하고초(Spica prunellae) 추출물의 항비만 및 산화적 스트레스 억제활성

본 실험에 사용된 하고초는 강원도 인제 야산에서 자란 자연산으로 5월경에 채취하여 일광에 말린 지상부 전초를 강원약초(Wonju, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Ethanol 과 methanol은 (주)삼전(Pyeongtaek, Korea)에서 구입하였 으며, Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), Hank's balanced salt solution(HBSS), streptomycin, penicillin은 Gibco BRL.(Carlsbad, CA, USA)에 서 구입하였다. Phosphate-buffer saline(PBS)은 WELGENE Inc.(Daegu, Korea)에서 구입하였다. Calf serum(CS)은 GE Healthcare Bio-Sciences Co.(Piscataway, NJ, USA)에서 구입 하였으며, Oil Red O(ORO), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone(Dex), insulin, dichlorodihydro fluorescein diacetate(DCFH-DA), cupric sulfate는 Sigma- Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였 다. Acetone, 그리고 sodium hydroxide은 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)사로부터 구입하였으며 2,2'-Azobis(2- amidinopropane) dihydrochloride(AAPH)은 Wako Pure Chemical (Osaka, Japan)로부터 구입하여 사용하였다. 분쇄 기는 Queensmate DCM-5500(Seoul, Korea), Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA) reader 및 fluorescence reader는 Tecan (Salzburg, Austria)의 기기를 사용하였다.

건조된 하고초(전초)는 분쇄기를 이용하여 가루로 만든 후 50 g의 하고초를 1 L의 에탄올을 가하여 상온에서 shaking incubator HST-201MS-2R(Hanbaekst, Bucheon, Korea)를 이용하여 160 rpm의 조건에서 24 h 동안 추출하 였다. 추출물은 여과지(Hyundai micro No. 20)로 여과한 후, 이것을 진공회전농축기(Eyela N-1000, Tokyo Rikakikai, Co., Tokyo, Japan)로 40°C에서 농축하였다. 농축물은 100 mg/mL의 농도로 DMSO에 용해하여 이후 분석에 사용 하였다.

본 실험에 사용된 마우스 유래 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC; Rockville, MD, USA)에서 분양받아 사용하였다. 3T3-L1 전지방세포는 10% CS와 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin이 함유된 DMEM 배 지를 이용하여 37°C, 5% CO₂ 환경에서 배양되었다. 3T3- L1 전지방세포를 지방세포로 분화시키기 위하여, 전지방 세포가 confluent 상태가 된 2일 후 분화유도 배지로 교체 하였으며, 분화유도 배지(Differentiation medium; DM)로 교체한 날을 Day 0라 표기하였다. 분화유도 배지는 10% FBS와 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin이 함유된 DMEM 배지에 500 μM IBMX, 1 μM Dex, 167 nM insulin을 포함하도록 준비하여 사용하였다. 분화유도 배지 는 Day 0에서 Day 2까지 48 h 동안 사용하였다. Day 2에 서 Day 4까지는 10% FBS와 100 unit/mL의 penicillinstreptomycin이 함유된 DMEM에 167 nM의 insulin만 포함 된 분화유도 후 배지(Post-differentiation medium; Post-DM) 를 사용하였으며, 이후 Day 4에서 Day 6까지 10% FBS와 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin이 함유된 DMEM (normal medium)을 사용하였다. 지방세포분화는 Day 6에 종료하였다(Fig.1).

Fig. 1. Scheme of PSE treatment and 3T3-L1 differentiation. DM: Differentiation medium, 10% FBS-DMEM containing 500 μM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone, and 167 nM insulin; Post-DM: Post differentiation medium, 10% FBS-DMEM containing 167 nM insulin.

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하고초 추출물의 항비만 활성을 평가하기 위해서, 지방 세포로 분화시킨 3T3-L1 세포의 지방축적량을 ORO 염색 법을 통해 정성 및 정량분석 하였다. 3T3-L1 전지방세포는 50 그리고 100 μg/mL의 하고초 추출물에 Day -2에서 Day 2까지 처리되었다. 지방세포분화는 위에 설명한 방법에 의하 여 실시하였다. ORO 염색은 Day 6에 실시하였으며, Kim 등(2012)의 방법을 일부 변형하여 사용하였다. 분화된 3T3- L1 지방세포(Day 6)는 3.7%(v/v)의 formaldehyde로 30 min 동안 실온에서 고정시켰다. 고정 된 세포는 3 mg/mL의 ORO를 이용해 15 min 동안 실온에서 염색시켰으며, 염색 후에는 증류수를 이용해 3회 씻어 주었다. 염색된 지방세 포는 scanner를 이용하여 이미지를 얻었다. ORO 정량분석 은 염색된 지방세포에 200 μL의 DMSO을 가하여 세포내 ORO를 녹인 후 96-well plate에 50 μL/well씩 옮겨 ELISA reader(Tecan, Salzburg, Austria)을 이용하여 490 nm에서 흡 광도를 측정하였다. 하고초 추출물을 처리하지 않은 분화 된 지방세포를 대조군으로 하여 lipid accumulation(% of control)을 계산하였다.

분화된 3T3-L1 지방세포의 지방구(lipid droplet)의 수와 크기는 현미경 관찰을 통해 정성 분석 하였다. 위의 처리 방법과 동일하게 3T3-L1 전지방세포는 50 그리고 100 μg/ mL의 하고초 추출물에 Day -2에서 Day 2까지 처리하였다. 지방분화 역시 위의 방법과 동일하게 실시하였다. 분화된 Day 6의 3T3-L1 지방세포를 3.7%(v/v)의 formaldehyde를 이용해 실온에서 30 min 동안 고정시킨 후, 건조방지를 위 해 PBS를 채운 후 현미경으로 관찰하였다.

본 실험에 사용된 인간유래 HepG2 세포는 American Type Culture Collection(ATCC; Rockville, MD, USA)에서 분양받 아 사용하였다. HepG2 세포는 10% FBS와 10% antibiotics 가 함유된 DMEM 배지에 배양하였으며 5% CO₂, 37°C의 환경에서 일주일에 2-3회 1:3 ratio로 계대배양 하였다.

HepG2 세포를 5×10⁵ cells/well의 수로 전배양하고 50 그리고 100 μg/mL의 하고초 추출물을 800 mM의 ethanol 과 같이 24 h 동안 처리한 후 5mg/mL의 MTT 용액을 1 h 처리하였다. 그 후 DMEM 배지를 제거하고 처리된 HepG2 세포를 1mL PBS(pH 7.4)로 씻어 주었다. 수용액에 용해 되지 않는 MTT formazan을 400 μL dimethyl sulfoxide (DMSO)를 가하여 녹여 준 다음 ELISA reader(Tecan, Salzburg, Austria)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정 하였다.

AAPH 및 Cu²⁺로 유도시킨 산화적 스트레스에 대한 하 고초 추출물의 세포내 항산화 활성을 DCFH-DA를 이용하 여 분석하였다. DCFH-DA를 이용한 세포내 항산화 활성 분석은 Lautraite 등의 방법을 일부 변형하여 사용하였다 (Lautraite et al., 2003). DCFH-DA는 세포막을 통해 세포 로 유입되면 세포질에 존재하는 esterase에 의해 DCFH로 가수 분해되는데 세포 내 활성산소가 존재하게 되면 쉽게 DCF로 산화되어 excitation 파장 485 nm, emission 파장 535 nm에서 그린색의 강한 형광을 나타낸다. 하고초 추출 물을 HepG2 세포에 처리한 뒤 산화적 스트레스를 유발하 면 세포내 항산화 활성 정도에 따라 차이적인 DCF 형광 강도를 나타내므로 이를 이용하여 하고초 추출물의 세포내 항산화 활성을 분석할 수 있다. HepG2 세포를 5×10⁵ cells/well의 수로 24 h 전배양하고 하고초 추출물을 30 min 동안 처리하였다. 배지를 제거한 후 50 μL의 HBSS로 1회 세포를 씻어 준 후 DMEM 배지를 제거하고 형광의 간섭을 받지 않는 HBSS로 교체해 주었다. 60 μM의 AAPH 또는 10 μM의 CuSO⁴ 용액을 가하고 30 min 동안 배양한 후 40 μM의 DCFH-DA를 처리해 준 후 30 min 동 안 추가 배양하였다. 형광분석기(Tecan, Salzburg, Austria)를 이용하여 excitation 485 nm, emission 535 nm에서 형광의 강 도를 측정하여 하고초 추출물의 세포내 항산화 활성을 정량 분석 하였다.

모든 데이터는 평균±표준편차로 표현하였으며, 통계처리 는 Statistical Package for Social Science(SPSS, Chicago, USA)을 이용하여 분석하였다. 신뢰수준 p<0.05 수준에서 평균값들에 대한 유의성을 검증하였으며 각 항목은 일원배 치 분산분석(one-way ANOVA) 하였고, 각 구간의 유의성 차이는 t-test로 검증하였다(*p<0.05, **p<0.01, 및 ***p<0.001).

하고초 추출물의 항비만 활성을 평가하기 위하여 3T3- L1 지방세포 분화모델을 이용하였으며, 분화유도과정이 끝 난 후 ORO 염색법으로 평가하였다. ORO 염색시약은 세 포내 지질과 결합하며, 염색된 세포의 붉은색이 강할수록 세포내 중성지질 축적이 많이 이루어졌음을 의미한다. 본 실험에서 하고초 추출물이 3T3-L1 전지방세포에서 세포독 성을 나타내는지 알아보기 위해 MTT 분석법을 통하여 세 포 생존률을 분석하였으며, 하고초 추출물 100 μg/mL 이하 에서 세포 생존률에 영향을 미치지 않았다. 따라서 이후 실험에는 50 및 100 μg/mL의 하고초 추출물을 실험에 이 용하였다(data not shown). 하고초 추출물을 3T3-L1 세포 에 Day -2에서 Day 2까지 96 h 동안 처리하고, Day 6에 ORO 염색을 실시하였다. Day 6에 ORO 염색시약을 DMSO 로 용해하여 정량분석한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조 군(지방세포)을 100%로 하였을 때 50 및 100 μg/mL의 하고 초 추출물은 각각 25.87% 및 31.83%의 지방세포 분화를 억 제하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Effect of PSE treatment on the adipogenesis of 3T3-L1 cells. 3T3-L1 preadipocytes were subjected to adipogenesis in the presence of 50 and 100 μg/mL of PSE. The levels of lipid accumulation of 3T3-L1 cells were quantified at 517 nm. *p<0.05 versus adipocytes (control).

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지방세포 분화유도 과정이 끝난 후 3T3-L1 지방세포내 축적된 지방구의 숫자와 크기를 현미경을 이용하여 정성분 석 하였다. 전지방세포에서는 거의 지방구가 발견되지 않았 으며, 하고초 추출물을 처리하지 않고 분화유도만 시킨 대 조군은 다량의 지방구가 형성되었음이 관찰되었다. Figure 2의 결과와 유사하게, 50 및 100 μg/mL의 하고초 추출물은 농도 의존적으로 3T3-L1 세포내의 지방구 수와 크기를 감 소시켰다(Fig. 3). 본 결과는 하고초 추출물이 비만의 예방 에 있어 중요한 adipogensis 과정을 억제하여 항비만 소재 로서의 가능을 보여주는 결과라 할 수 있다.

Fig. 3. Microscopy observation of lipid droplets in 3T3-L1 cells after treatment with PSE. 3T3-L1 cells were treated with 50 and 100 μg/mL of PSE between Day -2 to Day 2. The cells were stained with Oil Red O and the number and size of lipid droplets in 3T3-L1 cells were observed by microscope.

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최근 연구들은 비만 및 대사성 질환 치료제 개발에 있어 부작용 및 독성의 위험성을 최소화하고자 천연물을 이용한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 소리쟁이 ethyl acetate 추출 물이 PPAR 및 C/EBPα의 발현 감소를 통해 adipogenesis를 억제한다고 보고하였으며(Park et al., 2013), 기장 물 추출물 은 PPARγ와 SREBP1의 adipogenic 전사인자 조절을 통해 adipogenesis를 억제한다고 보고되었다. 참취 메탄올 추출 물은 PPARγ 및 C/EBPα의 발현을 억제함으로써 지방구 형성 및 중성지질 생성을 감소시켰다고 보고되었다(Choi et al., 2013). 선행 연구들과 같이, adipogenesis에 발현되는 adipogenic 전사인자의 조절은 비만예방에 있어 중요한 역 할을 하고 있음을 보여주는 결과이며, 추후 하고초 추출물 이 어떠한 신호 전달체계를 통해 adipogenesis를 조절하는 지에 대한 추가적 연구가 요구된다.

하고초 추출물을 50 및 100 μg/mL로 30 min 처리한 후 800 mM의 ethanol을 24 h 처리하여 세포독성을 유도하고 하고초 추출물이 HepG2 세포의 생존률에 미치는 영향을 분석하였다. 800 mM ethanol 처리에 의해 HepG2 세포는 대조군과 비교하여 60%의 세포 생존율을 나타냈다. 100 μg/mL의 하고초 추출물은 ethanol 처리군과 비교하여 유의적으로 ethanol에 의해 유도된 세포사멸을 79.3% 보호 하였다(Fig. 4). 비록 50 μg/mL의 하고초 추출물에서는 유 의적 차이는 없었지만 본 실험 결과는 하고초 추출물이 ethanol로 유도된 세포사멸을 감소시킬 수 있다는 결과를 보여주며, 하고초 추출물이 산화적 스트레스에 보호효과를 가질 수 있다는 가능성을 보여준다.

Fig. 4. Protective effect of PSE against ethanol-induced oxidative stress in human hepatoma HepG2 cells. The cells were pre-treated with 10, 100, and 200 μg/mL of PSE for 30 min, and stress was initiated by 800 mM ethanol treatment. The cell viability was examined by MTT assay. *p<0.05, **p<0.01 versus ethanol treatment.

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최근 세포내 활성산소를 측정하는 방법으로써 여러 연구자 들에 의해 DCFH-DA법이 널리 이용되고 있다(Lebel et al., 1990; Rosenkranz et al., 1992). 동물세포의 세포막 투과성을 가진 DCFH-DA가 세포질로 유입되게 되면 세포질에 존재 하는 esterase에 의해 DCFH-DA는 DCFH로 가수분해 되 고, 활성산소가 존재하게 되면 형광을 띄지 않던 DCFH는 활성산소에 의해 빠르게 산화되어 형광을 띄는 DCF의 형 태로 전환된다. 그러므로 형광현미경 및 형광분석기를 통 해 DCF의 형광강도를 측정하면 ROS 발생에 대한 정성 및 정량 분석이 가능하다. 본 실험에서는 HepG2 세포에 농도별 하고초 추출물을 처리하고 peroxyl radical generator로 잘 알려진 AAPH 및 hydroxyl radical 발생에 관여하는 전이금속 중 하나로 알려진 Cu²⁺를 처리하여 발 생되는 DCF의 형광 강도를 측정함으로써 하고초 추출물의 산화적 스트레스 억제활성을 평가하였다.

AAPH로 산화적 스트레스를 유도한 결과 대조군(100%) 대비 46.5%의 활성산소가 증가하였다. 반면 30 min 동안 하고초 추출물을 10, 100 및 200 μg/mL의 농도로 처리 한 뒤 60 μM의 AAPH를 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 결과, 하고초 추출물은 농도 의존적이며 유의적으로 AAPH로 유도된 산화적 스트레스를 억제하였으며, 특히 200 μg/mL의 하고초 추출물은 대조군 수준 (98.9%)으로 산 화적 스트레스가 억제된 것을 알 수 있었다(Fig. 5). Cu²⁺로 산화적 스트레스를 유도하였을 때, 대조군(100%) 대비 55.65%의 활성산소가 증가한 것을 알 수 있었다. AAPH를 사용한 방법과 마찬가지로 30 min 동안 하고초 추출물을 10, 100 및 200 μg/mL의 농도로 처리 한 뒤 10 μM의 Cu²⁺를 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 결과, 하고초 추출물은 농도 의존적이며(Fig. 6) 유의적으로 Cu²⁺로 유도 된 산화적 스트레스를 억제하였다. 특히 100 및 그리고 200 μg/mL의 하고초 추출물은 Cu²⁺로 유도된 산화적 스트 레스를 각각 24.8% 및 40.8% 감소시켰다. AAPH에 의해 발 생되는 ROO·은 항산화제의 수소전달에 의해 안정화 되는 것으로 잘 알려져 있다(Huang et al., 2005). 따라서 본 결과 는 하고초 추출물의 생리활성 성분에 의한 수소공여능이 AAPH에 의한 산화적 스트레스 억제에 기여했을 것으로 생 각된다.

Fig. 5. Cellular antioxidant activity of PSE against AAPHindued oxidative stress in HepG2 cells. Antioxidant function of PSE was examined in 60 μM AAPH-treated HepG2 cells in the absence or presence of 10, 100, and 200 μg/mL of PSE. Data are mean with standard deviation (n=9) obtained from three individual experiments. *p<0.05, **p<0.01 versus AAPH treatment.

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Fig. 6. Cellular antioxidant activity of PSE against Cu²⁺-induced oxidative stress in HepG2 cells. Antioxidant function of PSE was examined in 10 μM Cu²⁺-treated HepG2 cells in the absence or presence of 10, 100, and 200 μg/mL of PSE. Data are mean with standard deviation (n=9) obtained from three individual experiments. *p<0.05, **p<0.01 versus Cu²⁺ treatment.

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최근 연구에 따르면 지방세포내 과도한 지방 축적은 ROS의 발생을 증가시킨다고 보고되었다. 지방세포는 에너 지 저장을 위해 에너지 대사경로를 통해 지방을 축적한다. 특히, hexose monophosphate (HMP) 경로는 지방 합성에 필수적인 NADPH를 생성하는데, 이는 NADPH oxidase (NOX)에 의하여 NADP+로 전환되게 된다. 이때, 다량의 ROS를 생성하게 되어 전지방세포의 분화를 증가시키며 주 변의 대식세포를 자극하여 다양한 ROS의 발생을 증가시키 므로 산화적 스트레스는 비만과 밀접한 관련이 있음이 보 고되었다(Lee et al., 2009; Lee et al., 2013). 또한, 전이금 속(철 또는 구리 이온)과 H₂O₂에 의한 hydroxyl radical 생 성의 억제에 기여하는 주요한 2가지 인자로서 전자공여능 (electron donating activity)과 metal chelating 활성이 잘 알 려져 있다. 전자공여능은 생성된 HO·에 전자를 주어 HO·를 안정시키는데 기여할 수 있으며, metal chelating 활성은 2가 전이금속이 H₂O₂와 반응하는 것을 차단 또는 지연시킴으로써 HO· 생성을 억제시킬 수 있다. 따라서 이 후 연구는 하고초 추출물의 어떠한 bioactive components 가 3T3-L1 adipogenesis의 억제에 관여하고 있는지를 밝혀 야 하며, AAPH와 Cu²⁺로 유도된 산화적 스트레스를 하고 초 추출물이 어떠한 기전으로 억제하는지에 대한 분자생물 학적 탐색이 추가적으로 요구된다.