홍삼분말 입자크기에 따른 이화학적 특성 분석

본 실험에 사용한 홍삼분말 3종은 헬스밸런스(주)(Seoul, Korea)로부터 제공받았으며, 서로 다른 입도 분포를 가졌 다(Table 1).

홍삼분말의 입도 분석은 입도분석기(Mastersizer 3000; Malvern, Worcestershire, UK) 장비와 Hydro EV 분산 장치 (Malvern)를 이용하여 측정하였다.

홍삼분말의 색도 측정은 표준 백색판(L*=97.79, a*=-0.38, b*=2.05)으로 보정된 색도계(CR-300; Minolta, Tokyo, Japan) 를 사용하여 L*(명도, lightness), a*(적색도, redness), b*(황 색도, yellowness)값으로 나타내었으며, 4회 반복하여 측정 하였다.

본 실험에서 홍삼 용액은 홍삼분말을 증류수에 2.6% (w/ v) 농도로 분산시킨 후 sodium azide 99.0% (Samchun Pure Chemical, Pyeongtaek, Korea)를 홍삼분말의 0.1% (w/w) 농 도로 첨가하여 제조하였다. 제조 후 홍삼 용액은 desicator, 냉장고(FRB-5640NT; Dongbu Daewoo Electronics, Seoul, Korea), incubator (HB-103M; Hanbaeck, Bucheon, Korea) 를 이용하여 4°C, 25°C, 40°C에 4주 동안 저장하였으며, 저 장기간에 따른 갈색도, 지방산패도를 측정하였다. 또한 제 조 직후 24시간 동안의 분산안정성을 확인하였다.

저장온도 및 저장기간에 따른 홍삼 용액의 갈색도의 변화 는 원심분리기(Micro-12; Hanil science industrial, Kimpo, Korea)를 이용하여 8000 rpm에 10분간 원심 분리한 후 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) 를 이용하여 흡광도 294 nm에서 측정하였다. 해당 파장대는 전 스펙트럼 중 시료의 흡광값을 가장 잘 흡수하였다.

저장온도 및 저장기간에 따른 홍삼 용액의 지방산패도를 확인하기 위해 Turner et al. (1954)의 2-thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) 분석방법을 일부 수정하여 측정 하였다. Thiobarbutric acid (TBA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 trichloroacetic acid (TCA; Samchun Pure Chemical)의 혼합 용액 4.5mL과 홍삼 용액 0.5mL을 15mL conical tube에 옮긴 후 95°C 항온수조(BF-30SB; Biofree, Seoul, Korea)에서 15분간 가열 후 4°C 물에서 냉각하였다. 냉각한 시료는 원심분리기(1736R; LaboGene, Seoul, Korea) 를 이용하여 4°C에서 10분간 3000 rpm으로 원심분리하였 으며, 시료의 상등액을 취하여 spectrophotometer를 이용하여 535 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 지방산패도 값은 시 료의 malonaldehyde (MA) 양을 mg/kg으로 나타내었으며, blank는 증류수를 이용하였다.

홍삼분말을 증류수에 2.6% (w/v) 농도로 분산시킨 후 Turbiscan (Turbiscan expert lab. Formulation, Toulouse, France) 을 이용하여 25°C에서 1시간 간격으로 24시간 동안 분산안정 성을 측정하였다. 시료의 분산안정성은 backscattering flux와 turbiscan stability index (TSI)값으로 표현하였다. Backscattering 값은 시료가 담긴 용기에 광선을 조사하였을 때 위치에 따 라 반사되어 나오는 양을 정량적으로 나타낸 값으로 backscattering 값이 클수록 분산정도가 크다고 할 수 있다. TSI 값은 시간에 따른 분산안정성의 변화인 데이터간의 면 적을 적분 및 누적한 값으로, TSI 값이 클수록 분산안정성 이 좋지 않은 것을 의미한다. TSI 의 공식은 다음과 같다.

$\text{TSI = }\sqrt{\frac{{\displaystyle \sum _{\text{i=1}}^{\text{n}}{\left({\text{x}}_{\text{i}}{\text{-x}}_{\text{BS}}\right)}^{\text{2}}}}{\text{n-1}}}$

항산화 효능, 진세노사이드 함량 및 조성을 확인하기 위 해 다양한 입도의 홍삼분말을 열수추출하였다. 90°C 항온 수조(BF-30SB; Biofree, Seoul, Korea)에서 홍삼분말 50 g 에 증류수 250 mL을 넣고 3시간 가열추출 후, 증류수 250 ml을 추가로 첨가하여 총 6시간 동안 가열추출을 진행하였 다. 홍삼 추출물 500 mL은 filter paper (Whatman No. 1) 를 이용하여 여과한 후 동결건조기(FD8518; Iishinbiobase, Dongducheon, Korea)를 이용하여 동결건조하였다.

동결건조된 홍삼분말 추출물 시료의 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) free radical에 대한 소거활성은 Blois (1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. HPLC 등급 methanol (Samchun Pure Chemical)을 이용하여 시료를 농도별로 희석한 희석액 160 μL과 0.4 mM DPPH 용액 40 μL를 가하여 25°C 암소에서 10분간 반응시켰으며, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 methanol를 가하여 동일한 방법으로 측정하였으 며, 시료 자체의 색에 대한 흡광도 값을 보정하기 위해 0.4 mM DPPH 대신 methanol을 넣어 같은 방법으로 흡광 도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도 를 50% 이상 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 IC₅₀ 값 으로 표현하였다.

$\begin{array}{l}\text{DPPH free radical\hspace{0.17em}소거활성}\\ \text{= (1 - }\frac{\text{시료첨가흡광도 - 시료자체색흡광도}}{\text{시료무첨가흡광도}}\text{) × 100}\left(\text{\%}\right)\end{array}$

홍삼분말의 열수추출 및 동결 건조한 시료의 ABTS free radical을 이용한 항산화능 측정은 Re et al. (1999)의 방법을 변형하여 측정하였다. 14mM 2,2–azinobis-3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 4.9mM potassium persulfate (Sigma-Aldrich,)를 최종 농도로 혼합하여 실온인 암소에서 12시간 동안 반응시켜 ABTS+ 양이온을 형성시킨 후 732 nm에서 흡광도 값이 0.70(±0.02)이 되게 pH 7.4 phosphate buffer saline 용액(Sigma-Aldrich)으로 희 석하였다. 희석된 용액 180 μL와 증류수로 농도별로 희석 한 시료 20 μL를 실온인 암소에서 10분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH free radical 소거 활성과 같은 방법으로 ABTS free radical 소거활성을 계산 하였으며, 시료를 첨가하지 않은 흡광도를 50%로 환원시 키는 필요한 시료의 농도인 IC₅₀ 값을 구하였다.

$\begin{array}{l}\text{ABTS free radical\hspace{0.17em}소거활성}\\ \text{= (1 - }\frac{\text{시료첨가흡광도}}{\text{시료무첨가흡광도}}\text{) × 100}\left(\text{\%}\right)\end{array}$

홍삼분말의 ginsenoside 함량은 Ko et al. (2008)와 Kim et al. (2008)의 조건을 응용하여 측정하였으며, HPLC (1100 system; Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하였다. HPLC column은 YMC-Pack ODS AM (250 × 4.6mm, 5 μm; YMC, Wilmington, NC, USA)을 사용하였고, 흡광 파장 203 nm, 유속 1.0 mL/min, 분석온도 40°C로 설정하였다. 이동상은 HPLC grade 증류수(solvent A)와 HPLC grade acetonitrile (solvent B; J.T. Baker, Center Valley, PA, USA)을 사용하 였으며, gradient 조건으로 solvent B의 비율을 초기 6분간 17%로 흘려주고, 29% (3 min), 40% (5 min), 70% (3 min), 90% (1.5 min), 90% (3.5 min), 17% (30 sec), 17% (3.5 min) 로 순차적으로 조절하였다.

실험 결과는 SPSS 12.0 통계 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 일원배치분산분석 후 Duncan's multiple range test로 유의성 검증(p<0.05)을 실시하였으며, 진세노사이 드 함량 유의성 평가는 one-way ANOVA를 사용하였으며, 사후 검정은 Bonferroni post-test를 실시하였으며, p<0.05 미 만을 유의한 것으로 간주하였다.

홍삼(non-puffed red ginseng, RG)분말 3가지의 D₅₀ (평균 입도크기)는 Table 1과 같다. 홍삼분말의 D₅₀은 158.00 μm, 8.45 μm, 6.33 μm으로 측정되었으며, 본 실험의 측정항목에 서는 다양한 입도의 홍삼분말을 RG A (158.00 μm), RG B (8.45 μm), RG C (6.33 μm)으로 표현하였다.

입자크기에 따른 홍삼분말의 L*, a*, b*값의 평균값은 Table 2와 같다. RG A, RG B, RG C의 L*값은 72.27±0.57, 84.15±0.47, 84.95±0.38 으로 RG B와 RG C는 서로 유의 적인 차이를 보이지 않았으며(p>0.05), RG A보다 높은 L* 값을 나타내었다. 이는 홍삼분말 입자크기와 색도가 밀접 한 관계가 있음으로 생각되어지며, 홍삼분말 입자크기가 작을수록 L*값이 증가하는 것으로 생각된다. Seo et al. (2002)은 분쇄방법에 따른 홍삼분말의 색도를 조사한 결과, 120 mesh 통과분 90% 이상인 홍삼분말이 120 mesh 통과 분 88% 이상인 홍삼분말보다 L*값이 높다는 것을 확인하 였다. 홍삼분말의 RG A, RG B, RG C의 a*값은 3.32, 0.43, 0.24이었으며, b*값은 20.30, 12.40, 11.45를 나타내었 으며, 모든 값이 유의적인 차이를 나타내었다(p<0.05). Kum et al. (1993)과 Kum et al. (1999)은 쌀가루의 입자가 작을 수록 a*, b*값이 감소한다고 보고한 바 있으며, 이는 본 실 험 결과와 유사하다.

입자크기에 따른 2.6% (w/v) 홍삼분말이 증류수에 분산 되었을 때 저장온도(4°C, 25°C, 40°C) 및 기간에 따른 색 상 변화를 확인하기 위해 294 nm에서 흡광도를 조사하였 으며, 결과는 Fig. 1과 같다. Fig. 1에서 볼 수 있듯이, 4°C 에 저장한 RG C는 다른 시료와 다르게 저장 2주를 제외 한 저장기간에 따른 유의적인 보이지 않았다(p>0.05). 또한 4°C에서 저장한 RG A 및 C를 제외한 모든 시료는 저장 온도와 관계없이 저장 기간에 따라 흡광도 값이 감소하였 으며, 유의적인 차이를 보였다(p<0.05). 이와 반대로 Seo et al. (2002)은 홍삼분말의 물 추출물을, Han et al. (2008) 은 홍삼의 주정추출물을 420 nm 흡광도에서 조사하였을 때, 시간에 따라 흡광도 값이 모두 증가하였다고 보고하였 으며, 이와 같이 흡광도 값이 반대로 나온 것은 시료의 추 출 유무와 관련이 있다고 생각되어진다.

Fig. 1. Changes in absorbance values of RG solution (2.6%w/v) during 4 week storage at 4°C (A), 25°C (B), and 40°C (C). Different letters mean between means of different temperatures (A through B) and means of different storage times (a through b) are significantly different at p<0.05.

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입자크기에 따른 홍삼 용액(2.6%, w/v)의 저장온도(4°C, 25°C, 40°C) 및 기간에 따른 TBARS 분석 결과는 Fig. 2와 같다. RG A, RG B, RG C 용액의 저장온도(4°C, 25°C, 40°C) 및 기간에 따른 TBA가는 저장온도(4°C, 25°C, 40°C)와 상관없이 저장기간에 따라 각각 0.075-0.084, 0.078-0.083, 0.072-0.083으로 유의적으로 증가하였으며(p<0.05), 특히 25°C 및 40°C에 저장한 홍삼 용액이 4°C에 저장한 홍삼 용액보다 유의적으로 높은 TBA가를 가졌다(p<0.05). 본 실험의 TBA가는 0.1 미만의 낮은 값을 보였으며, 이는 홍 삼분말에 함유된 지방 함량이 1% 정도의 미량이기 때문인 것으로 사료된다(Kwon et al., 1989; Kwon et al., 1990).

Fig. 2. Changes in TBA values of RG solution (2.6 %w/v) during 4 week storage at 4°C (A), 25°C (B), and 40°C (C). Different letters mean between means of different temperatures (A through B) and means of different storage times (a through b) are significantly different at p<0.05.

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입자크기에 따른 홍삼 용액(2.6%, w/v)의 backscattering flux는 Fig. 3과 같으며, 분산 안정성 측정 직후를 나타내 는 것은 분홍색으로 표시하였다. RG B와 C의 경우, 분산 직후 backscattering 값이 시료 전반적으로 분포되어 있지 만(Fig. 3B, 3C), RG A의 경우, 분산 직후 시료가 바로 침전되어 용기의 바닥부분으로 갈수록 backscattering 값이 증가한 것을 볼 수 있다(Fig. 3A). 이를 통해 입자크기가 분산안정성에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다(Park et al., 2009; Cho et al., 2012). Fig. 3D는 시료 RG A, B, C의 분산안정성을 비교한 TSI 값으로 10시간 기준으로 RG B가 RG C보다 입자크기가 큼에도 불구하고 분산안정성이 좋았으며, 10시간 이후에는 TSI 값 차이를 보이지 않았다. 이는 분산 직후 RG C의 입자간 뭉침현상이 일어난 것으 로 추측되어지며, 10시간 이후에는 RG B와 RG C 입자 대부분이 침전이 이뤄져 TSI 값 차이를 보이지 않은 것으 로 사료된다. RG A의 경우, 분산 직후 바로 침전됨에도 불 구하고 RG B, C 보다 TSI 값이 낮게 나와 분산안정성이 높게 나왔으며(Fig. 3D), 이러한 상반된 결과는 RG A의 침 전이 빠르게 일어나 상층액에 남은 일부 입자의 분산도가 측정되어 낮은 TSI 값을 보인 것으로 사료된다. 홍삼분말의 분산안정성은 홍삼분말을 이용한 홍삼제품 가공공정에 중요 한 요인이 되며, RG A보다 입자가 작은 RG B 및 C가 홍 삼제품 가공 공정에 적합한 것으로 고려되어진다.

Fig. 3. Dispersion stability profile of different particle size RG solution (2.6%w/v) during 24 hours observation. Backscattering values of RG A (A), RG B (B), and RG C (C) are shown, and TSI value (D) are shown, respectively.

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홍삼분말 입자크기에 따른 DPPH free radical 소거정도 에 의한 항산화 활성은 Table 3과 같다. 홍삼분말 열수추 출물 농도가 2.74-3.34 mg/mL와 2.77-2.95 mg/mL일 때 각 각 50%의 DPPH radical 소거능과 50%의 ABTS radical 소거능을 보였으며, 유의적인 차이는 보이지 않았다 (p>0.05). 6년근 홍삼분말의 에탄올 추출물은 6.25 mg/mL 에서 약 16%로 낮은 DPPH radical 소거능을 보였으며, 3.13 mg/mL 일 때 20.74%의 ABTS free radical 소거능이 있는 것으로 보고된 바가 있다(Hwang & Ahn, 2011). 또 한 60 mesh 이하의 백삼분말의 DPPH radical 소거능은 농 도 1 mg/mL일 때 12.07%로 낮은 활성을 보였다고 보고된 바 있다(Kim et al., 2016). 따라서 본 실험에서의 DPPH 및 ABTS free radical 소거능은 높은 값을 가지고 있다고 사료되며, 이는 홍삼분말화에 따른 표면적 증가로 활성성분 이 보다 많이 추출된 것으로 사료된다(Ryu et al., 1979; Cho et al., 2008). 하지만 홍삼분말 입자크기에 따른 유의적 차이가 없는 것(p>0.05)은 RG B와 RG C의 뭉침 현상에 기인한 것으로 고려된다. Cho et al. (2008)은 분말 입자크 기는 표면력 및 추출용매에 대한 보수력과 관계 있으며, 이 에 따라 분말 입자가 작을수록 분말 뭉침 현상을 유발되어 추출용매로의 성분확산이 줄어든다고 보고한 바 있다.

홍삼분말 입자크기에 따른 RG A와 RG C의 ginsenoside Rg₁, Re, Rf, Rh1, Rg₂(s), Rg₂(r), Rb₁, Rc, Rb₂, Rb₃, Rd, Rg₃(s), Rg₃(r), Rh₂(s) 등 14종의 함량은 Table 4와 같으며, ginsenoside의 S형과 R형은 화학구조상 이성체를 의미한다. Table 4와 같이, RG A 및 RG C의 총 ginsenoside 함량은 24.28mg/g 및 24.53mg/g으로 유의적인 차이를 보이지 않았 으나, RG C의 ginsenoside Rg₁, Re, Rh₂은 RG A보다 유의 적으로 높은 함량 값을 보였으며(Rg₁, Re, Rh₂; p<0.001), Rb₂, Rc는 유의적으로 낮은 함량 값을 보였다(Rb₂; p<0.001, Rc; p<0.01). 이를 통해 홍삼분말 입자크기에 따라 ginsenoside 함량이 변화한다는 것을 알 수 있었으며, Cho et al. (2008) 은 500.00 μm, 170.54 μm, 60.00 μm의 ginsenoside Rg₁, Re, Rh₂, Rc, Rb₂의 전체 함량에 대한 비율은 각각 11.30-14.08%, 10.81-11.34%, 0.91-1.67%, 12.70-13.30%, 10.88-11.38%이며, 입자크기에 따른 함량 변화가 존재한다고 보고한 바 있다.