홍삼정과 제조 부산물 이용에 관한 연구: 반응표면분석을 이용한 총 진세노사이드 추출조건의 최적화

본 실험에 사용된 홍삼정과 부산물은 금산소재 D사에서 공급받아 0.3 mm 간격으로 잘라 -80°C의 deep freezer (DF8514, Ilshin Bio Base, Yangju, Korea)에 보관하면서 시료 로 사용하였다. 추출용매 에탄올은 식용주정(Korea Ethanol Supplies Co., Seoul, Korea)으로 사용하였으며 ginsenoside 표준시약으로 Rg₃ (Chengdu Biopurify Phytochemicals, Sichuan, China) 등 20종을 사용하였다. Acetonitrile (Merck, Darmstadt, Germany)은 HPLC 분석용으로 사용하였다.

홍삼정과 부산물 중 진세노사이드 추출은 Sung & Yang (1985)의 방법을 응용하여 진행하였다. 즉, 일정한 크기 (0.3 mm)로 자른 홍삼정과 부산물 100 g에 중량대비 추출용 매(X₁, 에탄올 30-90%, v/v) 10배량을 가한 후 shaking bath (HB-250SW, Hanbaek Co. Ltd., Bucheon, Korea)에서 100 rpm으로 shaking하면서 추출온도(X₂, 25-70°C), 추출시간(X₃, 5-11 hr)동안 추출하였다. 추출이 완료된 후 여과포로 1차 여 과한 여액은 10,000 ×g에서 20분간 원심분리(Supra 2000, Hanil Scientific Inc., Seoul, Korea)시켜 침전물을 제거시킨 다음 상등액을 감압농축기(NE-1000SW, Eyela Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하여 최종 시료로 사용하였다.

홍삼정과 부산물 중 진세노사이드 추출 최적조건을 도출 하기 위하여 반응표면분석에 적합한 D-optimal design에 따라 실험을 설계하였다(Table 1). 독립변수(X_n)로는 추출 공정에 영향을 미칠 것으로 예상되는 추출용매 농도(X₁), 반응온도(X₂) 및 반응시간(X₃)을 설정했으며 종속변수(Y_n) 는 추출수율(Y₁) 및 총 진세노사이드 함량(Y₂)으로 하였다. 추출수율은 다음과 같이 계산하였다.

$\begin{array}{l}\text{Yield (\%)}\\ \text{=}\frac{\text{추출된 진세노사이드 추출액의 가용성 고형분 함량(g)}}{\text{홍삼정과 부산물의 가용성 고형분 함량(g)}}\text{×100}\end{array}$

추출 최적조건의 도출을 위해 설계된 18개의 실험구간에 대한 종속변수 및 독립변수 상호작용은 Modde 프로그램 (Ver. 5.0, Umetrics, Umea, Sweden)을 사용하여 분석하였다.

가용성 고형분 함량은 식품공전에 준하여 측정하였다. 즉, 시료 50 mL를 항량을 구한 수기에 취하여 105°C에서 증발 건조시켜 무게를 측정하여 수분의 함량을 측정하였다. 그리 고 100 에서 수분함량을 빼어 고형분 함량을 구하였다.

총 진세노사이드 조성 및 함량은 Table 1의 추출조건으 로 추출된 시료를 HPLC용 메탄올에 용해한 후 이를 membrane filter (0.2 μm pore size, Whatman Co., Kent, England)로 여과, HPLC (Agilent 1200, Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA)에 10 μL씩 주입하여 분석하였으며, 검출기는 YMC Pro C18 RS (YMC Co., Ltd, Kyoto, Japan) 을 장착한 HPLC system (Agilent 1200 series system with DAD detector at 203 nm)을 이용하여 분석하였다. 분석조 건은 이동상으로 용매 A (water)와 용매 B (acetonitrile)를 사용하여 gradient 조건으로 용매 B의 비율을 초기 20%로 흘려주고 25분까지 24%, 30분까지 33%, 42분까지 37%, 57분까지 80%, 58분까지 100%, 68분까지 60%, 70분까지 20%로 순차적으로 유속 1 mL/min로 흘려주었다(Lee et al., 2015). 진세노사이드 표준물질은 순도 99% 이상의 Rg₃ (Chengdu Biopurify Phytochemicals, Sichuan, China)등 20 종의 진세노사이드를 이용하여 검량곡선으로 하여 피크면 적에 의하여 환산하여 정량하였다.

모든 실험 결과들은 2회 반복 측정하여 평균치와 표준편 차로 나타내었으며, 각 처리별 평균치간의 유의성 검정은 SAS version 9.40 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 ANOVA 분석 후 p<0.05에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성 검증을 하였다.

홍삼정과 부산물로 각 추출조건에 따른 수율 및 총사포닌 함량을 Table 2에 나타내었다. 추출용매 농도, 추출온도, 추 출시간을 달리한 18개 구간에서 추출액의 추출수율은 25.79- 87.91%의 범위로 추출용매 농도 30%, 추출온도 70°C, 추출 시간 11시간 조건(No. 15 실험구)에서 가장 높았으며, 추 출용매 농도 90%, 추출온도 25°C, 추출시간 5시간 조건 (No. 2 실험구)에서 가장 낮은 추출수율을 나타냈다. 각 독 립변수 값의 변화에 따른 반응변수의 값을 등고선으로 표 현한 후 추출수율의 변화를 분석한 결과(Fig. 1), 각 독립 변수인 추출온도와 추출시간이 증가할수록 추출수율은 증 가하는 것으로 나타났고, 반면, 추출용매 농도가 증가할수 록 추출수율은 감소하는 것으로 나타났다. 최대 수율을 유 도한 조건(No. 15 실험구)을 기본으로 하여 각 독립변수 값의 변화에 따른 추출수율에 prediction plot을 Fig. 2에 나타내었다. Fig. 2에 의하면 추출용매 30% (v/v)에서 추 출수율 83.5%, 50%에서 79.8%, 70%에서 66.3%, 90%에 서 44.1%로 추출용매 중 에탄올 농도가 증가함에 따라 수 율은 약 1.89배 감소할 것으로 예측되었다. 이는 고농도의 에탄올을 추출용매로 사용할 경우 홍삼정과 부산물에 함유 된 다량의 전분(26.2-36.6%), 다당류, 펙틴, 단백질 등의 수 용성 고분자 물질들이 거의 용출되지 않고 또한, 조직의 팽 윤이 저해되어 초래된 결과로 추정되었다(Sung, 1983; Sung & Kim, 1986; Ko et al., 1992).

Fig. 1. Contour plots for yield of extraction saponins with respect to the extraction condition.

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Fig. 2. Response prediction plot for the effect of ethanol concentration, temperature, and time on the extraction yield.

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또한, 추출온도의 변화에 따른 추출수율의 변화는 최소 추출온도인 25°C에서 62.1%, 최대 추출온도인 70°C에서 78.3%로 온도가 상승함에 따라 추출수율이 증가하는 경향 을 보였으며, 이는 에탄올 농도가 낮고 추출온도가 증가할 수록 고분자 물질(전분, 펙틴, 단백질 등)이 조직 내에서 추출이 원활해져서 추출수율이 증가하였음을 보고한 Sung & Kim (1986)의 결과와 유사한 것으로 사료되었다.

추출시간의 변화에 따른 추출수율은 5시간 78.4%, 7시간 74.7%, 11시간에서 79.6%로 추출시간 7시간에서 다소 감 소하다 증가하였으나 유의적 차이는 없었다(p > 0.05).

따라서, 추출용매 농도 및 추출온도의 변화에 따른 추출 수율의 변화와 비교하였을 때 약 1.06배 더 낮은 것으로 예측되어, 추출용매 농도에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.

각 추출조건에 따른 총 진세노사이드 함량을 분석한 결 과는 Table 2-4에 나타냈다. 추출용매 농도, 추출온도, 추 출시간을 달리한 18개 구간에서 추출액의 총 진세노사이드 함량은 1.89-10.07 mg/g의 범위로 에탄올 농도 70%, 추출 온도 40°C, 추출시간 11시간 조건(No. 13 실험구)에서 가 장 높았으며, 에탄올 농도 90%, 추출온도 25°C, 추출시간 5시간 조건(No. 2 실험구)에서 가장 낮은 총 진세노사이드 함량을 나타냈다(Table 2). 각 독립변수 값의 변화에 따른 반응변수의 값을 등고선으로 표현한 후 총 진세노사이드 함량 변화를 분석한 결과(Fig. 3), 추출온도와 추출시간이 증가할수록 총 진세노사이드 함량은 증가하는 경향을 나타 냈고 반면, 추출용매 농도는 추출용매 농도 70%까지 총 진세노사이드 함량은 최대로 증가하다 이후 감소하는 것으 로 나타났다. 최대 총 진세노사이드 함량을 유도한 조건 (No. 13 실험구)을 기본으로 하여 각 독립변수 값의 변화에 따른 추출액의 총 진세노사이드 함량의 prediction plot을 Fig. 4에 나타냈는데, 추출용매 농도에 따른 총 진세노사이 드 함량의 변화는 30% 5.15 mg/g, 50% 8.40 mg/g, 70% 9.63 mg/g, 90% 8.78 mg/g로 추출용매 농도 70%까지 증가 하다 90%에서 약 1.38배 정도 감소되는 것으로 예측되었 다. 이는 Sung & Yang (1985)의 연구 결과와 유사한 경향 으로 높은 에탄올 농도(예, 90%)에서 프로토파낙사트리올 (protopanaxadiol, PPD)계 -Rb₂, -Rb₁ 등 일부 구성성분들의 추출이 감소하여 추출물 중 총 진세노사이드 함량이 감소하 며, 이는 용매의 극성 차이가 진세노사이드를 구성하는 성 분들의 용해도를 다르게 하여 진세노사이드 추출에 영향을 미친다고 하였다. Table 3

Fig. 3. Contour plots for of extraction saponins with respect to the extraction condition.

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Fig. 4. Response prediction plot for the effect of ethanol concentration, temperature, and time on the total saponins.

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또한, 추출온도에 따른 총 진세노사이드 함량의 변화는 최소 추출온도 25°C에서 8.38 mg/g, 최대 추출온도 70°C에 서 10.00 mg/g 으로 추출온도가 상승함에 따라 총 진세노사 이드 함량이 증가하는 경향을 나타냈다. Sung et al. (1985) 의 보고에 의하면 추출온도 100°C에서 진세노사이드 종류 에 따라 열에 대한 안정성이 낮아져서 총 진세노사이드 함 량이 감소한다고 보고하였으나 본 연구결과에서는 최대 추 출온도가 70°C로 추출액의 총 진세노사이드 함량에 영향을 미치지 않은 것으로 사료된다.

추출시간의 변화에 따른 총 진세노사이드 함량의 변화는 5 시간에서 6.49mg/g, 11시간에서 9.62mg/g으로 추출시간이 증가할수록 총 진세노사이드 함량은 증가하는 경향을 나타냈 다. 이는 Han et al. (2010)이 추출온도 75°C에서 홍삼 부위별 추출시간에 따른 총 진세노사이드 함량을 조사한 결과 동체 21시간(23.04mg/100mL), 지근 18시간(65.68mg/100mL), 세 근 12시간(295.92mg/100mL) 추출액에서 최고 함량을 나타 났다고 보고하였는데 본 연구 결과에서도 유사한 경향을 나 타냈다.

홍삼정과 부산물로부터 총 진세노사이드 추출 최적조건을 도출하기 위하여 추출용매 농도(X₁), 추출온도(X₂) 및 추출 시간(X₃)을 독립변수(X_n)로 설정한 후 D-optimal design에 의한 반응표면분석을 실시하여 최적화 조건을 도출하였다. 즉, 반응변수(Y_n)인 추출수율(Y₁) 및 총 진세노사이드 함량 (Y₂)의 변화를 회귀분석하여 독립변수의 일차항. 이차항, 교 호항을 통해 얻은 반응변수에 대한 반응표면회귀식과 유의 성을 Table 5에 나타냈다. ANOVA 분석에서 모델의 적합성 평가를 위한 lack of fit의 p-value는 0.05 이상이어야만 적합 한 모형이라 판단하며, R² (coefficient of determination)은 회 귀모델이 데이터를 얼마나 근접하게 예측하고 있는가를 나 타내는 척도가 되고, 그 수치가 1에 가까울수록 실험식이 실제 실험값과 일치하는 좋은 모형임을 나타낸다. 추출수 율과 총 진세노사이드 함량에 대한 lack of fit의 p-value는 각각 0.072 및 0.664로 본 실험의 수행을 위하여 가정된 모델(Table 1)은 적합한 것으로 판단되었고 추출수율과 총 진세노사이드 함량의 R² 값은 0.971 및 0.846로 나타났다. 추출공정의 최적조건을 찾기 위한 회귀분석결과, 추출용매 농도 57.90%, 추출온도 56.94°C, 추출시간 11시간일 때 추 출수율은 84.52%, 총 진세노사이드 함량은 9.54 mg/g로 예 측되었다.

이는 홍삼정과 제조시 당침액(올리고당, 설탕 등)이 홍삼 내로 침투하여 홍삼 중 총 진세노사이드 함량이 상대적으 로 감소하고 또한 제조 공정 중 고온 장시간 열처리가 추 가적으로 진세노사이드 함량의 감소를 초래하는 것으로 사 료된다. Song et al. (2010)의 보고에서도 인삼정과 제조 후 총 진세노사이드 함량이 4.12-10 mg/g으로 분석되어 본 연구와 유사한 결과를 나타냈다.