배암차즈기 효소처리 추출물의 기능성분 및 항산화 활성

본 실험에 사용된 배암차즈기는 전북 부안군 동진농장영 농조합법인에서 2021년에 구입한 국내산 배암차즈기 열풍 건조 전초 및 열풍 건조 분말을 -20°C 냉동고에서 보관하 면서 실험에 사용하였다. 효소는 세포벽 분해 효소 pectinase (Pectinex Ultra SP-L), cellulase (Celluclast 1.5L FG), viscozyme (Viscozyme L)과 전분 분해 효소 α-amylase (Termamyl 2X)를 Novozymes (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)사에서 구입하여 사용하였다. 분석에 사용된 시약은 dinitrosalicylic acid (DNS), Folin-Ciocalteu’s reagent, gallic acid, glucose, catechin, sulfuric acid, potassium persulfate (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. 그 외 시약 및 용매는 분석용 특급시약(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였다.

구연산처리 조건 선정을 위하여 배암차즈기 분말 5 g에 구연산 분말(배암차즈기 분말 대비 0.8%, 효소 최적조건 pH 5.5 조절량과 동일)을 혼합한 후 증기 또는 압력 처리 하였다. 구연산 증기처리는 구연산 분말을 가정용 찜기에 서 온도 100°C, 15 min 동안 처리하였고, 구연산 압력처리 는 고압멸균기(Daihan Scientific, Wonju-si, Korea)에서 온 도 100°C, 압력 1 bar, 15분 동안 처리하였다. 구연산으로 전처리한 배암차즈기 분말을 효소처리에 사용하였으며 효 소처리는 세포벽 분해효소 pectinase (P), cellulase (C), viscozyme (V)를 1:1:1 비율로 혼합한 혼합효소 1종으로 진행하였다. 혼합효소는 1% (기질대비)를 첨가하여 50°C에서 2시간 동안 처리하였다. 2차 전분분해 효소인 Termamyl (T)를 동일량 첨가하여 93°C에서 2 h 동안 처리하여 구연 산 증기 효소처리구(S-PCV)와 구연산 압력 효소처리구(PPCV) 를 제조하였다. 효소의 불활성화를 위해 100°C에서 10min 동안 가열하였다. 추출물은 6,683×g, 15min 조건에서 원심분리(2236R, GYROZEN Co., Ltd., Gimpo-si, Korea) 를 하였고 여과지(Whatman No. 4, GE Healthcare Co., Bukinghamshire, UK)로 감압여과하였다. 이 상등액을 이용 하여 실험에 사용하였다. 대조구로 열수추출 처리구 (CON)는 분말 5 g에 20배에 해당하는 증류수를 가한 후 100°C, 2 h 동안 냉각환류추출장치(reflux)를 이용하여 추출 물을 제조하였다. 구연산 혼합 열수추출 처리구(C-CON)은 구연산을 혼합한 후 열수추출 처리구(CON)과 동일한 조건 으로 제조하였고 구연산 증기 전처리구(S-CON)은 구연산을 넣고 증기 전처리 한 후 열수추출 처리구(CON)과 동일한 조건으로 제조하였다. 구연산 압력 전처리구(P-CON)은 구 연산을 혼합하여 압력 전처리 한 후 열수추출 처리구(CON) 과 동일한 조건으로 제조하였다.

효소 종류 선정을 위한 구연산처리는 전처리 조건 선정 을 통해 선정된 압력처리 조건으로 진행하였다. 구연산 압 력처리된 배암차즈기 미분쇄 분말 5 g에 20배에 해당하는 증류수를 가하였다. 효소는 단일 또는 혼합 처리하였으며 고압멸균기를 사용하였다. 1차 세포벽 분해 효소처리는 pectinase (P), cellulase (C), viscozyme (V), pectinase와 cellulase를 1:1로 혼합 (PC), cellulase와 viscozyme을 1:1로 혼합 (CV), pectinase와 viscozyme을 1:1로 혼합 (PV), pectinase, cellulase, viscozyme을 1:1:1로 혼합 (PCV)하여 50°C에서 2 h 동안 진행하였다. 2차 전분분해 효소처리는 T를 배암차즈기 기질의 1% (w/w) 농도로 첨가하여 93°C 에서 2 h 동안 진행하였다. 전분분해효소 처리는 기존의 Nam et al. (2018)의 선행문헌을 변형하여 2시간으로 고정 하여 진행하였다. 대조구로 CON은 구연산처리 조건 선정 과 동일한 방법으로 제조하여 비교하였고, 다른 대조구 (CON-1)은 구연산과 효소를 첨가하지 않고 효소처리와 동 일한 방법으로 처리하였다. 구연산은 첨가하고 효소는 첨 가하지 않은 대조구(CON-2)도 효소처리와 동일한 방법으 로 제조하여 비교하였다.

효소처리 시간 선정은 효소처리 종류 선정 실험에서 최적 으로 선택된 P를 이용하여 진행하였다. 구연산 전처리 후 세포벽분해효소 P를 1% 첨가하여 50°C에서 1, 2, 4, 6 h 동 안 처리한 다음, 전분분해효소 T를 동일량으로 첨가하여 93°C에서 2 h 동안 처리하였다. 대조구로 CON은 구연산처 리 조건 선정과 동일한 방법으로 제조하여 비교하였다.

효소처리 농도 선정은 효소처리 시간 선정 실험에서 최 적으로 선택된 P 2시간 처리 조건을 이용하여 진행하였다. 구연산 전처리 후 세포벽분해효소 P는 0.2, 0.5, 1, 3% 농 도로 첨가하여 50°C에서 2 h 동안 처리한 다음, 전분분해 효소 T를 동일량으로 첨가하여 93°C에서 2 h 동안 처리하 였다. 대조구(CON)은 효소처리 시간 선정과 동일한 방법 으로 제조하여 비교하였다.

효소처리 대용량추출은 구연산, 효소처리 최적 조건으로 선정된 방법으로 진행하였다. 구연산처리는 배암차즈기 미분 쇄 분말 3kg에 구연산 분말(배암차즈기 분말 대비 0.8%, 24 g)을 혼합한 후 고압멸균기에서 121°C, 15min, 1 bar 조 건으로 처리하였다. 배암차즈기의 대용량 P 1% 처리구(L-P) 는 200 L 반응조에 물 57L를 넣고 예열하여 혼합물 내부 온도가 50°C에 도달하면 구연산처리된 배암차즈기 분말 3 kg을 넣고 혼합하였다. 1차 세포벽 분해 효소처리는 P를 기질 대비 1% (w/w)인 30 g을 투입 후 교반하여 50°C에서 2 h 처리하였다. 2차 전분 분해 효소처리는 T를 기질 대비 1%로 투입 및 교반하여 93°C에서 2 h 처리하였다. 효소 불 활성화를 위해 100°C에서 10min 동안 가열하였다. 각각의 추출액은 추출포(PP 부직포 재질, 60 × 70 cm, 2장)로 압착 여과하였고, 압착 여과된 추출액과 침전물은 각각 수분용해 지수(WSI)와 수분흡착지수(WAI) 분석에 사용하였다. 추출 과정 중 샘플링된 추출액은 6,683×g, 15min 조건에서 원심 분리(2236R, GYROZEN Co., Ltd., Gimpo-si, Korea) 한 후 상등액은 여과지(No. 4)로 감압여과 하였다. 이 상등액을 이 용하여 기능성분 함량 분석에 사용하였다. 효소처리에 대한 대조구(L-CON)은 구연산을 첨가하지 않고 동일한 분말시료 3 kg에 물 57L를 넣고 200 L 반응조에서 100°C, 2 h 동안 교반하여 열수추출하였고, 또다른 대조구(L-CP)는 업체 관 행 방법을 이용하여 앞과 동일량으로 100°C, 8 h 동안 열수 추출하였다. 대조구들은 L-P와 동일한 방법으로 여과한 후 분석에 사용하였고, lab-scale을 기준으로 하여 P와 L-P의 error range를 (%)로 나타냈다.

수분용해지수(water solubility index, WSI)는 배암차즈기 추출물을 여과한 후 상등액을 취하여 알루미늄 접시에 부 은 후 침전물 무게를 측정하고, 알루미늄접시를 열풍건조 기(ThermoStable OF-305, Daihan sci., Wonju-si, Korea)에 서 50°C, 24 h 동안 건조한 뒤 상등액의 고형분 함량을 측 정하였으며 산출식은 아래와 같다.

수분흡착지수(water absorption index, WAI)는 배암차즈 기 추출물의 상층액을 분리하고 침전물을 건조하여 그 무 게를 측정한 후 다음과 같은 식으로 구하였다.

총 폴리페놀(total polyphenols, TP) 함량은 Folin-Denis법 (Gutfinger, 1981)을 일부 변형하여 비색 정량하였다. 배암 차즈기 추출물 시료 0.1mL에 2% Na₂CO₃ 용액 2mL를 가하여 실온에서 3min간 방치하였고, 50% Folin reagent 0.1 mL를 가하고 잘 혼합하여 실온에서 30min간 정치한 후 750 nm에서 흡광도 값을 microplate reader (Infinite 200 PRO, TECAN, Austria)를 이용하여 측정하였다. 총 폴리페 놀 함량은 gallic acid (GA)를 표준물질로 사용하여 시료와 동일한 방법으로 시험하고 얻은 표준검량 곡선으로부터 환 산하여 정량하였다(gallic acid equivalent, mg GAE/g).

총 플라보노이드(total flavonoids, TF) 함량은 추출액 250 μL에 증류수 1mL와 5% NaNO₂ 75 μL를 넣은 후에 실온에서 5min간 방치하였다. 이후 10% AlCl₃·6H₂O 150 μL를 첨가하고 6min간 방치한 후 1M NaOH 500 μL 를 가하였다. 11min 후, 510 nm에서 반응액의 흡광도 값을 microplate reader기를 사용하여 측정하였다. 표준물질로는 (+)-catechin hydrate (CE)를 이용하여 검량선을 작성하였고, 총 플라보노이드 함량은 시료 g당 mg으로 나타냈다.

총 당(total sugar, TS)은 Dubois et al. (1956)의 phenol sulfuric acid 법을 이용하였고, 감압여과한 상등액을 50배로 희석한 후 사용하였다. 희석하여 얻은 시료 0.5mL를 넣고 혼합한 후 sulfuric acid 2.5mL를 가하여 발열시켰다. 이 혼합 액을 실온에서 30min 동안 방치한 후 microplate reader기를 사용하여 470 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 당 정량은 glucose를 표준물질로 사용하여 표준곡선으로부터 환산하였다.

환원당(reducing sugar, RS)은 Miller (1959)의 DNS 방 법에 의해 측정하였다. 감압여과한 상층액을 1-2배로 희석 하였고, 희석된 시료 1mL에 DNS 시약 3mL를 넣어 혼 합한 후 끓는 물에서 5min간 중탕한 다음 냉각하여 25 mL volumetric flask에 넣고 증류수로 정용하였다. 흡광 도는 550 nm에서 측정하였으며 포도당 함량에 상당하는 값(glucose equivalent, GE, g%)으로 나타냈다.

배암차즈기 추출물인 대조구(CON)와 효소처리 P 1% 처 리구(P)의 주요 기능성분들을 분석하기 위해 UPLC-DADQToF/ MS를 사용하여 실험을 진행하였다. 분석조건으로 CORTECS→ (UPLC→ T3, 2.1 × 150 mm, 1.6 μm) 칼럼과 CORTECS→ UPLC→ T3, 2.1 × 5mm, 1.6 μm pre 칼럼을 사 용하였다. 또한 액체크로마토그래피 SCIEX ExionLC AD UPLC와 연결된 X500R QTOF-MS (AB SCIEX, Framingham, MA, USA) 질량분석기를 이용하여 분석하였다. 검출 대표 파장은 210-400 nm이며, 페놀산은 320 nm, 플라보노이드는 350 nm를 대표파장으로 선정하였다. 칼럼 오븐온도는 30°C, 유속은 0.3 mL/min이었다. 이동상으로는 용매 A (0.5% formic acid in H₂O)와 용매 B (0.5% formic acid in ACN)을 사용하였다. 용매 구배조건은 B를 5%로 시작 하여 20min까지 25%, 25 min까지 50%, 30min까지 90%로 증가시킨 다음 2 min 동안 유지하다가 35min까지 5%로 다시 감소시키고 40min까지 유지하였다. 질량분석기를 이 용한 질량 패턴분석은 positive ion mode로 진행하였다. 질 량 분석조건으로 capillary 전압은 3.5 kV, sampling cone 전압은 40V로 각각 설정하였다. Ion source 온도는 120°C 및 500°C로 설정하였고, 질량 스캔 범위는 m/z 100-1200 으로 설정하였다. 그 외 조건은 Table 1, 2에 나타내었으며, 개별 성분은 Flavonoid Data Base 1.0. (2016)을 참고, 각 성분의 질량 단편이온 패턴 분석 결과와 비교하여 구조 동 정하였다. 또한 성분 6종을 정량 분석하기 위해 내부 표준 물질로 nepetin 100 ppm 표준품을 구매하여 시료와 1:1로 희석하여 분석을 진행하였다.

Table 1. Analytical conditions of UPLC for Salvia plebeia extract

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Table 2. Analytical conditions of LC-MS for Salvia plebeia extract

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마우스 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포(macrophase) 는 한국세포주은행(KCLB; Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 구입하여 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Waltham, MA, USA)와 1% antibiotics (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)가 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco) 배지 를 이용하여 37°C, 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양 하였다. 배암차즈기 열수추출물(CON)과 효소처리 P 1% 추출물(P)는 각각 동결건조한 후 phosphate buffered saline (PBS; Gibco)에 용해 시켜 세포실험에 사용하였다.

RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4 × 10⁴ cells/well이 되도록 접종한 뒤 24 h 배양하였다. 각 시료를 농도별로 전처리하고, 1 h 후 0.5mM H₂O₂ 또는 100 ng/mL LPS를 첨가하여 24 h 배양하였다. 반응 종료 후 세포 생존율은 Ez-Cytox cell viability assay kit (DAEIL Lab, Seoul, Korea)를 사용하였으며, 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 대조군의 흡광도 값을 기준으로 상대적인 세포 생존율을 비교하였다.

RAW 264.7 세포를 96 well black plate에 4×10⁴ cells/ well이 되도록 접종한 뒤 24시간 배양하였다. 각 시료를 농도별로 처리하고 1 h 후 0.5mM H₂O₂를 첨가하여 24 h 배양하였다. 세포는 PBS (Gibco)로 세척하고 10 μM 2',7'- dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA, Sigma) 용액을 처 리하여 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후 PBS로 세척한 세포는 형광현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) 및 fluorescence microplate reader (Tecan)로 형광도(Ex: 510 nm, Em: 560 nm)를 측정하였다. 대조군의 형광도 값 을 기준으로 상대적인 ROS 생성량을 비교하였다.

항산화 효소 지표 효소인 SOD (superoxide dismutase), catalase를 대상으로 활성을 측정하였다. RAW 264.7 세포 를 6 well plate에 1×10⁶ cells/well이 되도록 접종한 뒤 24 h 배양하였다. 각 시료를 농도별로 처리하고 1 h 후 0.5 mM H₂O₂ 첨가하여 24 h 배양하였다. 항산화 효소 활 성은 enzyme assay kit (BioVision, San Francisco, CA, USA)를 사용하였으며, 제조사의 지침에 따라 측정하였다. SOD 활성을 평가하기 위해 세포를 lysis buffer (BioVision) 로 용해한 후 효소 활성 평가를 위한 시료로 사용하였다. 96 well plate에 20μL 시료, WST working solution 200 μL, dilution buffer 20 μL, enzyme working solution 20 μL를 넣고 37°C에서 20min 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. catalase 활성을 평가하기 위해 세포에 assay buffer로 용해한 후 효소 활성 평가를 위한 시료로 사용하였다. 96 well plate에 60μL 시료, assay buffer 18 μL와 catalase reaction solution 12 μL를 넣고 30min 반 응시킨 후 10 μL stop solution을 넣어 반응을 종료시켰다. 용액에 developer mix 50 μL를 넣고 10min 동안 반응시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군의 흡광도 값 을 기준으로 상대적인 효소 활성을 비교하였다.

RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4× 10⁴ cells/well이 되도록 접종한 뒤 24 h 배양하였다. 각 시료를 농도별로 처리하고 1h 후 100 ng/mL LPS를 첨가하여 24h 배양하였다. 반응 종료 후 상등액을 수거하여 NO 농도 측정을 위한 시료로 사용하였다. NO 농도는 Gries s r eagent a s sya k it (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 측정하였으며, 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 일산화질소 농도는 kit에 포함된 표준용액으로부터 산출된 표준곡선과 비교하여 결정하였다.

RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4 × 10⁴ cells/well이 되도록 접종한 뒤 24 h 배양하였다. 각 시료를 농도별로 처리하고 1시간 후 100 ng/mL LPS를 첨가하여 24 h 배양 하였다. 반응 종료 후 상등액을 수거하여 시료로 사용하였 으며, 사이토카인 농도는 ELISA assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하였으며, 제조사의 지침에 따라 측정하였다. Tumor necrosis factor-α (TNF- α), interleukin-1β (IL-1β) 그리고 interleukin-6 (IL-6)의 농 도는 kit에 포함된 표준용액으로부터 산출된 표준곡선과 비 교하였다.

자료의 통계 분석 처리는 SPSS (Statistical package for the social science, Ver 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 시행하여 평균과 표준편차를 산출하였고, 모든 분석 결과는 3회 반 복 측정하여 나타냈다. 각 시료 간 차이를 검증하기 위해 Student’s t-test 또는 Duncan’s multiple range test를 시행하 여 유의수준 5%에서 통계적 유의성을 검증하였다.

배암차즈기 추출물의 구연산처리 조건에 따른 수분용해 지수(WSI), 총 폴리페놀(TP) 및 총 플라보노이드(TF) 함량 측정 결과는 Table 3에 나타냈다. WSI는 대조구로 열수추 출 처리구(CON)이 27.77%, 구연산 혼합 열수추출 처리구 (C-CON)이 28.32%였으며 두 대조구 간의 유의적 차이는 없었다. 증기 구연산처리(S-CON) 또는 구연산 압력처리(PCON) 를 가한 열수추출 처리구는 각각 33.12, 35.57%로 CON에 비해 유의적으로 증가하였다. 증기 구연산처리(SPCV) 또는 구연산 압력처리 한 효소처리구(P-PCV)는 각 각 40.38, 41.05%로 CON에 비해 약 1.5배 증가하였으며 유의적으로 가장 높은 값을 나타냈다(p<0.001). Go & Choi (2016)는 3% 농도에서 염산 처리한 쪽잎 열수추출물 을 고압멸균기에서 반응시켰을 때 최대 수율을 나타냈으며 이는 가수분해되어 생성물이 증가하였다고 보고했는데 본 연구결과를 뒷받침해주는 것이라 사료된다. 이러한 결과는 배암차즈기에 구연산 전처리를 통하여 1차적으로 산분해를 진행시켰고 효소가 작용할 수 있는 최적의 환경을 극대화 하여 수용화 정도가 높게 나타난 것으로 생각된다.

Table 3. Water solubilization and functional components content of Salvia plebeia extracted by pre-treatment with citric acid

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TP는 C-CON이 42.61 mg GAE/g이었으며 이와 비교했 을 때 S-CON (57.07 mg GAE/g)이 1.3배, P-CON (58.74 mg GAE/g)이 약 1.4배 많았으며, 동일한 구연산처리를 한 효소처리구인 S-PCV, P-PCV는 약 1.5배 정도 유의적으로 높게 나타났다(p<0.001). TF 또한 TP와 유사한 경향이었으 며 C-CON이 39.06 mg CE/g이었고, 구연산 증기 구연산처 리 또는 압력 구연산처리한 열수추출 처리구와 효소처리구 모두 CON (37.82 mg CE/g)에 비해 그 함량은 약 1.2배 증가하였다(p<0.001). 다양한 구조를 가진 폴리페놀계 물질 들은 한 분자 내에 phenolic hydroxyl (OH)기를 2개 이상 의 가진 방향족 화합물을 나타내며, 주성분은 탄닌 및 플 라보노이드로 항산화, 항암, 항고혈압 등 다양한 생리활성 기능을 가지는 것으로 알려져 있다(Yoshizawa et al,. 1987). 또한 폴리페놀 불용성 화합물이 식물의 세포벽에 결합되어 있다가 효소에 의한 가수분해로 다당류들과 이온결합 또는 수소결합하여 추출이 용이한 상태변화로 인해 용출되어 함 량이 증가한 것으로 생각된다(Cinar, 2005). 이상의 결과로 볼 때 물리적 처리(증기 또는 압력) 방법에 대한 차이는 없었지만, 화학적 처리(구연산) 및 효소적 처리에 따른 WSI, TP 및 TF 함량이 증가하는 것을 확인하여 압력 구 연산처리 후 효소처리를 하는 방법을 최적으로 선정하였다.

배암차즈기 추출물의 효소처리 종류에 따른 수용화 특성 및 기능성분 함량 측정 결과는 Table 4에 나타냈다. CON 은 WSI가 32.63%였고 혼합 효소처리구인 pectinase+ cellulase (PC), cellulase+viscozyme (CV), pectinase+ viscozyme (PV)는 43.44-44.03% 정도로 나타났으며 유의적 으로 가장 높게 나타났다(p<0.001). 수분흡착지수는(WAI) 5.52-9.96 g/g의 범위였고 단일 효소처리구인 pectinase (P), cellulase (C), viscozyme (V)와 혼합 효소처리구인 PC, CV, PV, PCV 시료 간에 유의적인 차이는 나타나지 않았 다. P의 TP함량은 59.55 mg GAE/g으로 가장 높은 함량을 나타냈으며 CON (34.56mg GAE/g)에 비해 1.7배 증가하 였다. Shirsat et al. (2011)은 배암차즈기를 열수추출하여 총 폴리페놀산을 측정한 결과 8.569mg/g으로 보고하였는 데, 이는 본 연구 결과보다 낮은 수치였다. 페놀 화합물의 함량변화는 재배지역, 추출조건(용매, 온도, 시간) 및 기타 환경조건 등을 포함하는 여러 가지 복합적인 요인으로 인 해 차이가 생기는 것이라고 추정된다(Makkar, 1999). CON 의 TF는 32.32 mg CE/g으로 가장 낮았고 P에서 56.84mg CE/g으로 유의적으로 가장 높았으며 TP와 비슷한 경향으 로 나타나는 것을 확인하였다(p<0.001). 총당(TS)는 4.91- 11.70%의 범위였으며 CV가 11.70%로 가장 많은 함량을 보였고, 환원당(RS)는 P (6.61%), V (6.87%), PC (6.51%), CV (6.60%), PV (6.76%), PCV (6.40%)가 가장 높게 나타 났다. 쌈잎채소 연구에서 75% 에탄올로 추출한 배암차즈 기의 총당 함량은 10.78%라고 보고하였으며 이는 본 연구 결과와 유사한 결과였다(Park et al., 2012). 이는 시료를 추출할 때 식물체의 복잡한 내부 및 세포벽 구조(셀룰로오 스, 펙틴 등)으로 인해 용매만으로는 모든 기능성 화합물 들의 유용성분을 용출하기 어렵기 때문에 물리적․화학적 또는 효소처리 등의 처리과정을 통해 좀 더 효과적으로 추 출한 것으로 판단된다(Nam et al., 2019). 이러한 결과로 효소처리에 적합한 효소종류로는 TP와 TF 함량이 가장 높 은 Pectinex Ultra SP-L (P) 펙틴분해효소로 결정하였다.

Table 4. Solubilization characteristics and functional components content of Salvia plebeia extract depending on type of enzyme treatment

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배암차즈기 추출물의 효소처리 시간에 따른 수용화 특성 및 기능성분 함량 측정 결과는 Table 5에 나타냈다. WSI 는 CON이 32.63%로 가장 낮았고 P 2h 처리구에서 41.68%로 CON에 비해 약 1.3배 유의적으로 증가하는 것 으로 나타났다(p<0.001). 이러한 결과로 P 2 h 처리시, 고 형분의 수용화 및 분해에 더 효과적인 것으로 확인되었다. Kim et al. (2015)는 청파래의 효소가수분해 연구에서 반응 시간에 따른 수율을 조사했는데 반응 6~36 h까지 수율이 증가하다가 48 h에서 감소했다고 보고하여, 본 연구에서도 일정시간 이후인 P 2 h 처리 이후부터는 WSI가 감소하는 것으로 나타나 본 실험결과와 유사한 경향이었다. WAI는 P 2 h 처리구에서 5.53 g/g으로 가장 낮게 나타나 다당류가 가장 많이 분해된 것으로 판단되었다. TP는 34.56-59.55 mg GAE/g 범위였으며 처리시간이 길어질수록 증가하다가 감 소하는 경향을 보였는데 P 2h 처리구에서 59.55 mg GAE/g으로 유의적으로 가장 높은 함량을 나타냈다 (p<0.001). TF 또한 TP와 유사한 경향이었으며 P 2 h 처리 구에서 56.84 mg CE/g으로 가장 높은 함량이었고 2 h 이 후로는 함량값이 감소하는 경향으로 나타났다. 총당은 5.47-10.98%, 환원당은 3.46-9.35% 범위였고 모두 P 6 h 처리구에서 각각 10.98, 9.35% 함량으로 가장 높게 나타났 다. 총당은 1, 2, 4 h 처리구간의 유의적인 차이는 없었고 환원당은 처리시간이 길어질수록 그 함량 값도 증가하는 경향으로 나타났다. Yan et al. (1998)은 식물체 세포벽을 분해하는 효소인 polygalacturonase와 글루코시드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소인 β-glucoside 등의 효소작용을 보고하였다. 이러한 결과는 다양한 식물체 유형에 적절한 효소를 처리했을때 식물체의 가수분해 효율을 증대시킬 수 있는 요소라고 생각된다. 결과적으로 효소처리 최적시간은 TP 및 TF 함량이 가장 높게 나타난 P 2 h 처리로 선정하 였다.

Table 5. Solubilization characteristics and functional components content of Salvia plebeia extract depending on time of enzyme treatment

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배암차즈기 추출물의 효소처리 농도에 따른 수용화 특성 및 기능성분 함량 측정 결과는 Table 6에 나타냈다. WSI 는 P 1% 처리구에서 41.68%로 유의적으로 가장 높았으며, CON (32.63%)에 비해 약 1.3배 증가하였다(p<0.001). WAI는 5.53-8.07 g/g 범위였고, P 1% 처리구에서 5.53 g/g 으로 가장 낮게 나타났다. WSI는 다당류가 가수분해되어 수용화된 정도를 나타내는 것이며 WAI는 물리적인 효소처 리에 의해서도 분해가 덜 일어나고 남은 고형분의 수분 흡 수량을 의미하는 것으로 WSI와 WAI의 결과는 서로 역의 상관관계에 있다. TP는 P 1% 처리구가 59.55 mg GAE/g 으로 가장 높게 나타났으며 CON (34.56 mg GAE/g)에 비 해 약 1.7배 증가한 것을 확인하였다. TF도 TP와 유사한 경향을 보였는데 CON이 32.32 mg CE/g으로 가장 낮았고 P 1% 처리구에서 56.84 mg CE/g으로 유의적으로 가장 높 았다(p<0.001). 동결건조한 배암차즈기 물 추출물을 연구한 선행연구에서 TF 함량을 38.7mg/g이라고 하였으며, 본 연 구의 P 1% 처리구의 함량값이 더 높게 나타났다(Jeong et al., 2015). 결과적으로 같은 물추출물인데 반해 본 연구의 TF 값이 더 높게 측정된 것은 시료의 처리 방법에 의한 것으로 생각되며 효소처리를 통해 플라보노이드 함량이 증 대된 것으로 판단된다. Nam et al. (2020)의 연구에서 생 강의 열수추출물에 비해 효소처리 추출액이 TP, TF 함량 이 높았다고 보고하였는데, 이는 본 연구와 유사한 결과를 나타냈다. 이는 배암차즈기에서도 효소처리 농도를 1% 첨 가하여 반응시켰을 때 가장 높은 함량을 보였으며 소재는 다르지만 동일한 효소 및 첨가농도를 사용하였을 때, 기능 성분을 수용화시키는 방법으로 효과적임을 확인할 수 있었 다. TS는 효소첨가량이 증가할수록 그 값도 증가하는 경향 을 나타냈는데 P 3% 처리구가 10.67%로 가장 많은 함량 을 나타냈다. RS도 TS와 비슷한 경향으로 나타났고 3.46- 8.89% 범위를 보였는데 P 3% 처리구에서 8.89%로 가장 높게 나타났다. Song et al. (2011)은 열처리한 톳의 효소 가수분해 연구에서 반응 24 h, 기질농도 1%인 경우 효소 량이 증가할수록 환원당 함량도 증가한다고 보고하였는데 본 연구결과와 유사한 경향을 나타냈다. 이는 구연산처리 및 효소에 의해 침투가 용이해진 세포벽에 효소가 깊숙하 게 작용하여 반응한 결과라고 생각된다. 효소처리 추출물 의 생산 단가 등의 경제적인 면(효소 2만원/100 g)을 고려 하여 적정 효소처리 농도는 TP 및 TF 함량값이 더 높게 나타난 P 1% 처리구(P)로 선정하였다.

Table 6. Solubilization characteristics and functional components content of Salvia plebeia depending on concentration of enzyme treatment

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배암차즈기 추출물 CON과 P 처리구의 LC-QToF/MS 분 석으로부터 얻은 chromatogram과 fragmentation ion patten 을 비교한 결과는 Fig. 1과 같다. Flavonoid Data Base 1.0. (2016)을 토대로 최종 6종의 성분을 동정하였으며, 5 종의 플라보노이드와 1종의 페놀산 성분으로 규명하였다. 구조 동정된 화합물은 순서대로 6-hydroxyluteolin 7-Oglucoside, luteolin 5-O-glucoside (galuteolin), luteolin 7-Oglucoside (cynaroside), nepetin 7-O-glucoside (nepitrin), hispidulin 7-O-glucoside (homoplantaginin), rosmarinic acid 임을 확인하였다(Table 7). 또한 CON과 P 처리구의 크로마 토그램을 비교한 결과는 Fig. 2와 같다. 성분 6종을 정량 분 석하기 위해 내부 표준물질로 nepetin을 샘플에 넣고 함께 분석하였는데 24min대에 나타난 peak는 nepetin을 의미한다. 정량 분석 결과는 Table 8에 나타냈으며 6-hydroxyluteolin 7-O-glucoside, luteolin 5-O-glucoside (galuteolin), luteolin 7-O-glucoside (cynaroside), nepetin 7-O-glucoside (nepitrin), hispidulin 7-O-glucoside (homoplantaginin) 5종의 플라보노 이드 성분 및 rosmarinic acid 1종의 페놀산 성분 모두 CON보다 P 처리구에서 높은 함량을 나타내었다. 특히 플 라보노이드 성분들은 CON 대비 P 처리구가 6.6-9.5배까지 증진되는 효과를 확인하였다. Kil et al. (2020)은 열수추출 한 배암차즈기를 성분분석한 결과 rosmarinic acid가 전체 peak면적의 70%를 차지하고 있으며 가장 많은 양을 함유 한다고 보고하였는데, 본 연구에서도 6가지 기능성분들 중 에서 rosmarinic acid의 함량분포가 가장 많은 것으로 나타 나고 있어 본 연구의 분석결과를 뒷받침해주었다. 효소처 리를 함으로써 CON에 대비하여 5종류의 플라보노이드는 약 7.7배 증가하는 것으로 나타나 결과값이 높아진 것으로 사료된다.

Fig. 1. (A) LC Chromatogram and (B) positive ion mode MS spectra of 1-6 compound from Salvia plebeia extract. 1, 6- hydroxyluteolin 7-O-glucoside; 2, luteolin 5-O-glucoside; 3, luteolin 7-O-glucoside; 4, nepetin 7-O-glucoside; 5, hispidulin 7-Oglucoside; 6, rosmarinic acid; A, P, addition of citric acid 0.8%, 121°C autoclave for 15 min→P, pectinex 1%, 50°C autoclave for 2 h→T, termamyl 1%, 93°C autoclave for 2 h LC chromatogram; B, Positive ion mode MS spectra of 1 to 6 components.

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Table 7. Mass fragmentation ions of 6 kinds of compounds in Salvia plebeia extract

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Fig. 2. Comparison of LC chromatograms of (A) P, (B) CON from Salvia plebeia extract. 1, 6-hydroxyluteolin 7-O-glucoside; 2, luteolin 5-O-glucoside; 3, luteolin 7-O-glucoside; 4, nepetin 7-O-glucoside; 5, hispidulin 7-O-glucoside; 6, rosmarinic acid; ISTD, internal standard, nepetin; P, addition of citric acid 0.8%, 121°C autoclave for 15 min→P, pectinex 1%, 50°C autoclave for 2 h→T, termamyl 1%, 93°C autoclave for 2 h; CON, 100°C reflux for 2 h.

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Table 8. Quantitactive analysis and functional components content in Salvia plebeia extract (mg/100 g)

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배암차즈기 효소처리 대용량 추출물의 수용화 특성 및 기능성분 함량 측정 결과는 Table 9에 나타냈다. WSI는 대용량 대조구 L-CON (33.83%)에 비해 대용량 P 1% 처 리구(L-P)가 52.89%로 약 1.6배 증가하였으며 유의적으로 가장 높았고, WAI는 L-P에서 2.33 g/g으로 가장 낮게 나타 났다(p<0.001). TP 및 TF는 L-P 처리구에서 각각 85.58 mg GAE/g, 68.78 mg CE/g이었으며 유의적으로 가장 높았 고 L-CON은 각각 72.71 mg GAE/g, 53.34 mg CE/g으로 이에 비해 약 1.2, 1.3배 증가하였는데 효소처리를 함으로 써 항산화 성분 함량 용출에 효과적임을 확인할 수 있었다. Shin et al. (2020)의 연구에 의하면 배암차즈기 열수추출물 의 TP와 TF 함량은 각각 99.10 mg/g, 48.71 mg/g으로 나 타나 본 연구결과의 L-P 처리구와 유사한 값을 확인하였다. 총당은 업체 관행 처리구(L-CP) 7.10%, L-CON 7.69%, L-P 13.65%의 순이었으며 L-P가 L-CON에 비해 약 1.8배 유의 적으로 더 높게 나타났다(p<0.001). Jeong et al. (2014)는 열풍건조한 배암차즈기 열수추출물의 총당 함량이 7.19% 라고 보고하였으며 본 연구의 효소처리한 L-P의 값이 더 높게 나타났다. 이는 효소작용에 의한 당류의 분해로 단당 류가 증가하여 총당 함량이 증대된 것으로 생각된다. 환원 당은 L-P 처리구가 5.11%로 가장 높았는데 효소처리를 통 한 효소적 분해가 진행되었고 이로 인해 포도당, 과당 등 의 단당류와 이당류의 당분해가 많이 일어나 배암차즈기의 환원당 함량이 증가한 것으로 추정된다(Lee et al., 2012). 최종 선정된 P 처리구의 처리방법이 대용량으로 적용되었 을 때도 기능성분 함량이 증가하는 경향으로 확인되어 산 업체에서도 대용량 처리의 적용 및 활용할 수 있을 것으로 판단된다. 이를 뒷받침하기 위해 효소처리의 최적으로 선 정된 P 처리구를 lab-scale과 pilot scale에서 연구된 범위의 P와 L-P 처리구간 처리 용량에 대한 차이를 비교하여 Fig. 3에 나타냈다. 대용량 추출 용량에 대해 P와 L-P 처리구의 차이점을 나타냈는데, 이는 lab-scale에서 사용하는 교반기 와 pilot scale에서 사용하는 대용량 반응조의 크기, 교반기 의 표면적에 닿는 power, speed 등에 의한 차이인 것으로 생각된다(Marques et al., 2010). 또한 시료를 효소처리 했 을 때 용량 차이에 따라 효소활성의 최적 반응시간까지 도 달하는데 서로 다른 시간적 영향도 있을 것으로 판단된다 (Tufvesson et al., 2010). 이상의 결과로 효소처리를 진행하 기전 구연산처리 과정을 통해 배암차즈기의 세포벽 성분을 기능성분이 용출되고 효소작용이 용이하도록 1단계에서 산 분해 한 다음, 다음 과정인 효소처리 단계를 통하여 다당 류를 분해하여 기능성분의 수용화를 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

Table 9. Solubilization characteristics and functional components content of Salvia plebeia extract by pilot scale

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Fig. 3. Comparison of error range depending on different extraction capacity of Salvia plebeia extract. Abbreviations are the same as in Table 4. Express error range (L-P) in preparation for lab-scale (P) standards.

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RAW 264.7 세포에서 CON과 P 처리구의 세포 내 항산 화 및 항염증 활성을 평가하기 위한 농도를 설정하기 위해 RAW 264.7 세포의 증식에 미치는 CON과 P 처리구의 세 포 생존율을 확인하였다. 다양한 농도(0-800 μg/mL)의 CON과 P가 처리된 조건에서 24시간 동안 반응한 RAW 264.7 세포 생존율의 결과는 Fig. 4와 같다. 대조군의 세포 생존율 100%와 비교하였을 때, CON과 P 처리구는 800 μg/mL 농도까지 대조군과 유사한 수준으로 생존율이 유지 되었으며, 그룹 간 유의적인 차이는 없었다. 이에 대식세포 내 항산화 및 항염증 활성을 평가하기 위한 CON과 P 처 리구의 최고 농도는 800 μg/mL로 선정하였다. 또한 선행연 구들을 토대로 RAW 264.7 세포에 염증성 자극원으로는 1 μg/mL LPS를(Kim et al., 2021), 산화적 스트레스 자극 원으로는 0.5mM H₂O₂를(Kwon et al., 2019) 각각 처리하 여 배암차즈기 추출물의 활성을 평가하고자 하였다.

Fig. 4. Effects of CON and P on viability of RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with CON and P at various concentrations for 24 h. Cell viability was tested using EZ-cytox cell viability assay. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. Abbreviations are the same as in Fig. 1.

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과량의 활성산소종(ROS; reactive oxygen species) 생산 으로 유도되는 산화적 스트레스는 세포를 손상시키고 조직 에 비가역적인 변화를 유도하는데, 반응성이 큰 ROS 중 하나인 H₂O₂도 다양한 세포와 조직의 손상 및 사멸을 유 도하는 것으로 알려져 있다(Simon et al., 2000). 이에 본 연구에서는 H₂O₂를 처리하여 RAW 264.7 세포에 산화적 스트레스를 유도한 후 CON과 P 처리구의 세포 보호 활성 을 평가하고자 하였다. CON과 P 처리구를 1 h 전처리하고 0.5 mM H₂O₂를 첨가하여 24 h 후 세포 생존율을 확인한 결과, H₂O₂ 단독 처리군은 대조군과 비교하여 세포 생존율 이 59%로 감소하였으나 CON과 P 처리구를 전처리한 실 험군에서는 세포 생존율이 증가하였다. 특히, 800 μg/mL의 농도로 RAW 264.7 세포에 전처리했을 때, CON은 71%로, P 처리구는 77%로 크게 생존율이 증가하여 CON과 P 처리 구가 H₂O₂로 유도된 산화적 세포 손상을 억제할 수 있다 고 판단되었다. Meng et al. (2022)의 연구에서 배암차즈기 의 주요 플라보노이드 배당체인 dihydrohomoplantagin과 homoplantaginin이 산화 저밀도지단백질(ox-LDL)에 의해 유도된 제대정맥 내피세포의 산화적 손상 및 사멸을 억제 하는 것으로 보고하였다. 또한 Kim et al. (2023)은 배암 차즈기 에탄올 추출물 및 배암차즈기 주요 화합물인 rosmarinic acid가 dexamethasone에 의해 유도된 근육모세 포의 산화적 손상을 억제한다고 보고하였다. 이상의 결과 들로 보아, CON과 P 처리구의 대식세포 보호 활성은 배 암차즈기에 함유된 플라보노이드 및 페놀산에 의한 활성으 로 판단되었다. 또한 CON과 P 처리구의 활성을 비교하였 을 때, 400 μg/mL 이상의 농도로 전처리 시 P 처리구가 CON보다 유의적으로 높은 대식세포 보호 활성을 나타냈 다(Fig. 5). 이는 배암차즈기를 효소 처리했을 때 플라보노 이드 및 페놀산 함량이 증가한 결과와 일치하는 것으로, 효소 처리로 기능성분의 용출이 증대된 배암차즈기 효소처 리구는 H₂O₂로 유도된 산화적 스트레스로부터 대식세포 보호 효과를 높일 수 있었다. 다양한 연구에서 천연물 소 재로부터 플라보노이드, 폴리페놀 및 페놀산 등 지표성분 의 추출 수율을 높이기 위해 유기용매를 사용하고 있으며, 용매 혼합 사용은 100% 물보다 기능성분 추출에 유용하다 고 알려져 있다(Kim & Kim, 2019;Sultana et al., 2009). 배암차즈기의 주요 화합물로 알려진 nepetin, luteolin, homoplantaginin 및 rosmarinic acid 등은 용매 종류 및 비 율에 따라 추출 함량이 달라질 뿐 아니라(Li et al., 2014), 기능성에도 영향을 미친다(Ngo et al., 2018;Zengin et al., 2019). 본 연구에서 효소 처리로 배암차즈기의 기능성분 용출이 증대되어 산화적 스트레스로부터 대식세포 보호 효 과를 높였으나, 효소 처리 또한 추출용매가 100% 물인 것 을 감안하면 활성을 나타내는 CON과 P 처리구의 농도 (400 μg/mL 이상)가 다소 높을 수 있다고 판단되었다. 그 러나 유기용매의 잔존 위험성과 소비자 거부감이 큰 유기 용매 추출법보다 안전한 효소 처리법은 배암차즈기의 기능 성분 용출 및 기능성을 증대시킬 수 있는 효과적인 전처리 방법이라고 생각되었다.

Fig. 5. Effect of CON and P against H₂O₂-stimulated cytotoxicity in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with 0.5mM H₂O₂ for 24 h after pre-treatment with or without CON and P for 1 h. Cell viability was tested using EZ-cytox cell viability assay. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 compared with the control (none) group, ^*P<0.05 compared with the H₂O₂ treated group, ^≠P<0.05 compared with CON and P of same parts. Abbreviations are the same as in Fig. 1.

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CON과 P 처리구의 대식세포 보호 활성이 H₂O₂ 처리로 증가한 ROS 소거 활성과 관련하는지 평가하였다. CON과 P 처리구를 1 h 전처리하고 0.5mM H₂O₂를 첨가하여 24 시간 후 DCFH-DA probe를 이용하여 세포 내 ROS 생성 정도를 확인하였다. 그 결과, H₂O₂ 단독 처리군에서는 대 조군과 비교하여 210%로 ROS 생성이 증가하였다. 그러나 CON과 P 처리구를 전처리하였을 때, 400 μg/mL 이상의 농도에서 H₂O₂ 단독 처리군과 비교하여 ROS 생성이 유의 적으로 감소하였다. 특히, 800 μg/mL 농도로 전처리하였을 때, CON은 172%, P 처리구는 135%로 ROS 생성이 감소 하였으며, P 처리구가 CON보다 유의적으로 높은 활성을 나타냈다(Fig. 6A). 또한 형광현미경 관찰 결과에서도 ROS 생성을 나타내는 초록 형광의 세기가 H₂O₂ 단독 처리군에 서는 강하게 나타났으나 CON과 P 처리구를 800 μg/mL 농도로 전처리한 세포에서는 감소하는 것을 확인할 수 있 었다(Fig. 6B). Chang et al. (2015)은 높은 폴리페놀 및 플 라보노이드를 함유한 배암차즈기 물추출물이 tertbutylhydroperoxide (t-BHP)로 자극된 간세포에서 과발현된 ROS를 억제하여 세포 생존율을 증가시킬 수 있었다고 보고 하였다. 이상의 결과들로 보아, 폴리페놀 및 플라보노이드를 다량 함유하는 CON과 P 처리구는 H₂O₂ 자극으로 증가한 과량의 ROS를 감소시킬 수 있었으며, 이로 인해 대식세포 의 생존율이 증가했을 것으로 판단되었다. 또한 CON보다 P 처리구의 세포 내 ROS 소거 활성이 더 크게 나타난 것 은 효소처리로 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드의 용출 및 함량이 증가한 결과들과 일치한다고 판단되었다.

Fig. 6. Effect of CON and P against H₂O₂-stimulated ROS generation in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with 0.5mM H₂O₂ for 24 h after pre-treatment with or without CON and P for 1 h. After staining with DCF-DA florescent dye. (A) DCF fluorescence intensity was measured using a fluorescence microplate reader. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 compared with the control (none) group, ^*P<0.05 compared with the H₂O₂ treated group, ^≠P<0.05 compared with CON and P of same parts. (B) The morphological images were obtained by a fluorescence microscope (magnification 200×, scale bar 50 μm). These images are representative of at least three independent experiments. Abbreviations are the same as in Fig. 1.

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생체는 ROS에 방어하기 위해 비효소적 또는 효소적 항 산화 메커니즘을 가지는데, 효소적 작용은 ROS가 세포 내 물질에 손상을 주기 전에 ROS를 제거하는 직접적인 항산화 방어작용이다. 대표적인 항산화 효소인 SOD (superoxide dismutase)는 ROS의 하나인 superoxide anion radical을 H₂O₂로 변환시킨다. 또한 SOD에 의해 생성된 H₂O₂를 제 거하는 가장 효과적인 항산화 효소는 catalase로 산화적 스 트레스로부터 세포를 보호하는 역할을 한다(Kim & Ham, 2003). 본 연구에서는 H₂O₂ 처리로 유발된 산화적 스트레 스에 대한 CON과 P 처리구의 대식세포 사멸 억제 및 ROS 소거 활성이 항산화 효소인 SOD와 catalase의 활성 과 관련하는지 확인하였다. CON과 P 처리구를 1 h 전처리 하고 0.5mM H₂O₂를 첨가하여 24 h 후 단백질을 추출하여 항산화 효소 활성을 평가하였다. 그 결과, H₂O₂ 단독 처리 군에서는 대조군과 비교하여 SOD 활성은 55%, catalase 활성은 68%로 감소하였다. 그러나 CON과 P 처리구를 전 처리했을 때, SOD 및 catalase 활성이 증가하였다. SOD 활성은 400μg/mL 이상의 농도에서, catalase 활성은 800 μg/mL 이상의 농도에서 H₂O₂ 단독 처리군과 비교하여 유의적으로 활성이 증가하였다. 특히, 800 μg/mL 농도로 전처리하여 catalase 활성 변화를 확인하였을 때, CON이 81%, P 처리구가 86%로 증가하였으며, P 처리구가 CON 보다 유의적으로 높은 활성을 나타냈다(Fig. 7). Kim et al. (2014)의 연구에서 배암차즈기 메탄올 추출물이 SOD 유 사 활성 및 항산화 활성을 나타낸 것을 주요 화합물인 rosmarinic acid, homoplantaginin, luteolin에 의한 것이라고 보고하였으며, Qu et al. (2009)의 연구에서는 배암차즈기 의 주요 화합물인 homoplantaginin이 항산화 효소의 활성 을 증가시켜 H₂O₂로 유도된 산화적 스트레스로부터 간세 포의 손상을 억제하였다고 보고하였다. 이상의 결과들로 보아, 산화적 스트레스에 대한 CON과 P 처리구의 대식세 포 보호 효과는 배암차즈기가 함유하는 플라보노이드, 페 놀산 등의 기능성분이 SOD, catalase와 같은 항산화 효소 의 활성을 높임으로써 ROS를 소거하고, 최종적으로는 대 식세포의 사멸을 억제한다고 생각된다. SOD 활성에서는 두 시료 간 유의적인 차이를 확인할 수 없었지만, catalase 활성 결과에서 CON보다 P 처리구의 항산화 효소 활성이 더 크게 나타난 것은 효소 처리로 기능성분의 용출 및 함 량이 증가한 결과와 일치한다고 판단되었다.

Fig. 7. Effect of CON and P on activity of antioxidant enzymes in H₂O₂-treated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with 0.5 mM H₂O₂ for 24 h after pre-treatment with or without CON and P for 1 h. SOD (A) and catalase (B) activity was assessed by enzyme assay kit. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 compared with the control (none) group, ^*P<0.05 compared with the H₂O₂ treated group, ^≠P<0.05 compared with CON and P of same parts. Abbreviations are the same as in Fig. 1.

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Lipopolisaccharide (LPS)는 대표적인 염증 매개 물질이 며, 대식세포의 과도한 활성을 유발하여 NO 및 염증성 사 이토카인의 생성을 증가시킨다. 이렇게 과발현된 NO 및 염증성 사이토카인은 염증반응 악화시켜 DNA 손상 및 돌 연변이를 일으키고 다양한 질병을 유발한다고 알려져 있다 (Yoon et al., 2009). CON과 P 처리구가 대식세포에서 LPS 자극에 의한 NO 및 염증성 사이토카인의 생성을 억 제할 수 있는지 평가하였다. 그 결과, LPS 단독 처리군에 서는 대조군과 비교하여 13배 이상의 NO가 생성되었다. 그러나 CON과 P 처리구를 전처리했을 때, CON은 400 μg/ mL 이상의 농도에서, P 처리구는 100 μg/mL 이상의 농도 에서 유의적으로 NO의 생성이 감소하였다. 특히, 800 μg/ mL 농도로 전처리했을 때, LPS 단독 처리군과 비교하여 CON은 2.9배, P는 3.4배 NO 생성을 감소시켰다. CON과 P 처리구의 NO 생성 억제 활성을 비교하였을 때, 400 μg/ mL 이상의 농도로 전처리 시 P 처리구가 CON보다 유의 적으로 높은 활성을 나타냈다(Fig. 8). 또한 LPS 단독 처 리군은 대조군과 비교하여 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성이 현저히 증가하였다. 그러나 CON과 P 처리구를 전처리했을 때, 염증성 사이토카인의 생성이 감소하여 NO 생성 억제 활성과 유사한 결과를 보였다. 특 히, CON과 P 처리구는 IL-1β의 생성을 가장 효과적으로 억제하였다. 즉, CON과 P 처리구를 800 μg/mL 농도로 전 처리했을 때, LPS 단독 처리군과 비교하여 CON은 7.7배, P 처리구는 11.7배 IL-1β 생성을 감소시켰다. CON과 P 처리구의 염증성 사이토카인 생성 억제 활성을 비교하였을 때, TNF-α의 생성 억제 활성에는 두 시료 간 유의적인 차 이를 확인할 수 없었지만, IL-6와 IL-1β의 생성 억제 활성 에서는 200 μg/mL 이상의 농도로 전처리 시 P 처리구가 CON보다 유의적으로 높은 활성을 나타냈다(Fig. 9). LPS 로 염증을 유도한 대식세포에서 Jeong et al. (2012)은 배암차즈기 물 추출물이 NO와 prostaglandin E2 (PGE2)의 생성을 억제했다고 보고하였으며, Lee & Kang (2020)은 배암차즈기 용매 분획물의 항산화 활성이 높을수록 NO 및 염증성 사이토카인 생성 억제 활성이 높게 나타났다 고 보고하였다. Choi et al. (2015)은 rosmarinic acid, homoplantaginin 등 6종의 파이토케미컬을 함유한 배암차 즈기 메탄올 추출물이 관절염 마우스 모델에서 염증성 사 이토카인 생성을 억제하여 염증을 완화시켰다고 보고하였 다. 이상의 결과들로 보아, CON과 P 처리구가 LPS로 자 극된 대식세포에서 NO 및 염증성 사이토카인의 생성을 효 과적으로 억제한 것은 배암차즈기 내 플라보노이드, 페놀 산 등의 파이토케미컬과 관련되어 있다고 생각된다. NO 및 염증성 사이토카인 생성 억제 활성이 항산화 활성과 마 찬가지로 CON보다 P 처리구가 높게 나타난 것은, 배암차 즈기를 효소처리하였을 때 기능성분의 용출이 증가한 결과 와 일치한다고 판단되었다.

Fig. 8. Effects of CON and P on production of NO in LPS-treated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with 100 ng/mL LPS for 24 h after pre-treated with or without CON and P for 1 h. The concentration of NO in the culture medium was detected by the Griess reaction. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 compared with the control (none) group, ^*P<0.05 compared with the LPS treated group, ^≠P<0.05 compared with CON and P of same parts. Abbreviations are the same as in Fig. 1.

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Fig. 9. Effects of CON and P on production of pro-inflammatory cytokines in LPS-treated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with 100 ng/mL LPS for 24 h after pre-treated with or without CON and P for 1 h. The concentration of cytokines in the culture medium, including TNF-α (A), IL-6 (B), and LI-1β (C) was measured by the ELISA kits. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 compared with the control (none) group, ^*P<0.05 compared with the LPS treated group, ^≠P<0.05 compared with CON and P of same parts. Abbreviations are the same as in Fig. 1.

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