국내 식품산업 다빈도 사용 효소제 7종의 사용량 기반 세포독성 연구

본 연구에서는 일일섭취허용량(acceptable daily intake)이 설정되어 있지 않고 품목제조보고서(1960년-2019년)와 수 입신고서(2017년-2019년) 기반 국내에서 다빈도로 사용되 는 효소제를 선정하였다. 이를 바탕으로 종국(백국, 황국, 흑국), 프로테아제(곰팡이성, 세균성, 식물성), 국(국내산 분 말 1종/낟알 1종, 미국산 낟알 1종), α-아밀라아제, 트랜스 글루타미나아제, 셀룰라아제, 글루코아밀라제 등 7종의 효 소제를 세포독성시험 대상으로 선정하였다. 각 효소제의 생산 균주 및 기원은 Table 1과 같다.

Table 1. Establishment of the highest concentration of seven kinds of food enzyme for cytotoxicity study

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세포독성시험을 위한 최고 농도는 품목제조보고서(2017 년-2019년), 국민영양통(KHIDI, 2017) 및 소장액 부피를 고려하여 설정하였다. 즉, 품목제조보고서 신고대장에서 천 연기원 효소제 7종이 다빈도로 사용되는 가공식품 품목을 검토하고 최대사용량을 확인하였다. 일일섭취량은 품목제 조보고서 기반 효소제 7종이 다빈도로 사용되는 품목에 해 당하는 식품군(대분류) 또는 식품(소분류)을 국민영양통계 분류체계에 근거하여 조사하였다. 또한 체내 환경을 반영 하기 위해 실제 소장액 부피(100 mL)를 고려하여(Mudie et al., 2014) 다음과 같이 세포독성시험 최고 농도를 설정하 였다.

각 효소제별로 설정된 세포시험 최고 농도에서부터 2배 씩 희석하여 세포성장 저해 및 사멸 시험은 6개 농도에서, 젖산탈수소효소 분석 시험은 5개 농도에서, 세포 내 활성 산소종 생성 분석 시험은 6개 농도에서 수행하였다. 각 효소제의 경우 열처리하지 않은 활성화(native) 형태와 121°C, 15분 열처리에 의한 불활성화(inactivated) 두 형태 를 모두 세포실험에 사용하였다. 세포 처리 시간은 소장 내 체류시간(Römmele et al., 2016)을 고려하여 6시간으로 설정하였다. 각 효소제는 세포배양액에서 pH 및 세포독성 분석 파장에서 자체 흡광도를 확인 후 세포실험을 진행하 였다.

본 연구에서 사용한 장관상피세포인 Caco-2 세포와 흰쥐 호염기성 백혈병 RBL-2H3 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, South Korea)에서 분양 받아 사용 하였고, 10% heat inactivated fetal bovine serum, 페니실린 (100 units/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 첨가된 minimum essential medium (Welgene Inc., Gyeongsan, South Korea)과 Dulbecco’s modified eagle medium (Welgene Inc.)에서 37°C, 5% CO₂ 조건의 세포배양기(MCO-230AIC, PHCbi, Tokyo, Japan)를 이용하여 각각 배양하였다.

세포성장 및 사멸 시험은 water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1; Roche, Basel, Switzerland)을 이용하여 평가하였 는데, 각 효소제 자체의 흡광도가 440 nm에서 세포배양액 과 동일한 배경 수준으로 측정되었기 때문이다. Caco-2 세 포를 1 × 10⁴ cells/100 μL로 배양한 후 효소제를 농도별로 첨가하여 6시간 동안 배양하였다. WST-1 시약 10 μL을 각 각 첨가하고 4시간 동안 배양한 후 440 nm에서 흡광도를 microplate reader (SpectraMax^® M3, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.

효소제에 의한 세포막 손상은 CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity assay (Promega, Madison, WI, USA) 를 이용하여 세포막 손상에 따라 배양액으로 유출된 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH) 양을 측정하여 확인하였다. Caco-2 세포를 2 × 10⁴ cells/mL로 배양한 후 각 효소제를 농도별로 6시간 동안 처리한 뒤 원심분리하 여 세포 배양액 상층액을 분석에 이용하였다. 즉, 상층액 50 μL에 substrate mixture 50 μL을 첨가하고 30분간 반 응시킨 뒤 stop solution 50 μL로 반응을 종료시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다(SpectraMax^® M3, Molecular Devices).

효소제에 의한 세포 내 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 생성 정도는 세포막 투과성 2',7'-dichlorofluoroescein diacetate (H₂DCFDA; Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)를 이용하여 분석하였다. Caco-2 세포 를 1 × 10⁴ cells/100 μL로 배양한 뒤, 각 효소제를 농도별 로 6시간 동안 처리하였다. 이 후, 20 μM H₂DCFDA 용 액 100 μL을 첨가하여 30분간 암소에서 반응시킨 뒤 phosphate buffered saline로 2회 세척한 후 2',7'-dichlorofluorescein (DCF) 형광을 excitation 485 nm와 emission 535 nm에서 측정하였다(SpectraMax^® M3, Molecular Devices).

면역세포 탈과립화는 RBL-2H3 세포에서 히스타민 탈과 립 시 함께 용출되는 β-hexosaminidase의 양을 배양액에서 분석하여 확인하였다. RBL-2H3 세포를 3 × 10⁴ cells/100 μL로 24시간 배양한 뒤, 배양액을 modified-Tyrode’s buffer (pH 7.3)로 교체하여 1시간 동안 배양하였다. Modified- Tyrode’s buffer 조성은 119 mM NaCl (Sigma-Aldrich Co. Ltd., St. Louis, MO, USA), 4.74 mM KCl (Ducksan Pure Chemical Co., Ltd, Ansan, Korea), 2.54mM CaCl₂ (Ducksan Pure Chemical Co. Ltd.), 1.19 mM KH₂PO₄ (Sigma-Aldrich Co. Ltd.), 10 mM HEPES (N-(2-hydroxyethyl) piperazine- N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1- ethanesulfonic acid, Sigma-Aldrich, Co. Ltd.), 5 mM glucose (Sigma-Aldrich, Co. Ltd.), 0.1% (w/v) bovine serum albumin (Sigma-Aldrich, Co. Ltd.)이다. 다양한 농도의 효소제 또는 양성 대조군으로서 compound 48/80 (C48/80, 1 mg/mL, Sigma-Aldrich, Co. Ltd.)을 처리한 후 30분간 배양하였다. 반응을 멈추기 위해 10분간 얼음위에 방치한 후, 50 μL의 상층액과 동량의 modified-Tyrode’s buffer에 제조된 기질 용액(1 mM ρ-nitrophenyl-β-acetyl-glucosaminide, pH 4.5, Sigma-Aldrich Co. Ltd.)을 혼합하여 1시간 동안 37°C에 서 반응시켰다. 효소-기질 반응을 멈추기 위해 100 μL의 sodium bicarbonate (pH 10)을 첨가하고 415 nm에서 microplate reader (SpectraMax^® M3, Molecular Devices)를 이용 하여 흡광도를 측정하였다. 한편, 총 효소양을 측정하기 위 해 100 μL의 1% (v/v) Triton X-100 (Sigma-Aldrich Co. Ltd.)을 첨가하여 얼음위에서 30분간 반응시켜 남아있는 세 포를 lysis시킨 후, 동일한 방법으로 효소-기질 반응시켜 다 음과 같은 식에 의해 용출된 β-hexosaminidase의 양을 계 산하였다.

용출된 β-hexosaminidase (%) = 상층액의 흡광도/(상층액 + 세포 용해물) 흡광도

모든 실험결과는 3회 이상 반복 수행하여 평균과 표준편 차를 구하였으며, SAS 프로그램(version 9.4, SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 one-way ANOVA 분석 후 Tukey’s test를 이용하여 시험군과 대조군과의 유의성을 p<0.05 수준에서 검정하였다.

품목제조보고서를 기반으로 효소제들이 첨가되는 품목 을 확인한 결과, 종국, 프로테아제, 국, α-아밀라아제, 트 랜스글루타미나제, 셀룰라아제, 글루코아밀라아제 순으로 가공식품에 다수 첨가되는 것으로 조사되어 이들 7종류 효소제를 시험물질로 선정했다. 이들 효소는 각각 장류, 소스, 탁주/약주, 빵/곡류가공품, 어묵/어묵소시지, 맥주/곡 류가공, 곡류가공/주류에 다빈도로 사용되고 있는 것으로 확인되었고 최대 사용량은 Table 1과 같다. 이는 국민영 양통계분류상 조미료, 주류, 곡류 및 그 제품, 어패류 등 의 식품군(대분류)에 해당되어 이를 기반으로 일일섭취량 을 조사하였다. 국민영양통계분류 대분류 식품군 중 본 시험대상 효소제가 첨가되지 않는 식품 항목도 다수 포함 되어, 효소제가 실질적으로 첨가되는 대분류 내 세부 식 품항목의 총합으로써 일일섭취량을 도출하였다(Table 1). 이와 같이 최대 사용량과 일일섭취량 기반 도출된 양을 장내 부피 100 mL을 고려하여 설정한 세포시험 최고 농 도는 Table 1과 같다. 단, 설정된 세포실험 최고 농도가 1,000 μg/mL을 초과할 경우, 고농도 자체에 의한 false positive 효과를 초래할 수 있고 일반적으로 세포실험에 사용되는 농도를 고려하여 1,000 μg/mL를 최고 농도로 설정하였다(Böhmert et al., 2018).

효소제의 생산 균주나 원산지 등 기원이 다르거나 분말 및 낟알 등 형태가 다른 경우 모두 시험대상으로 선정하였 고, 효소제가 일반적으로 가공과정에서 열처리나 가공공정 에 의해 불활성화되는 점을 감안하여 native와 inactivated 두 가지 형태의 효소제를 모두 시험대상에 포함하였다.

다빈도로 사용되는 효소제 7종이 세포 성장 및 사멸에 미치는 효과를 확인하기 전에 WST-1 시약이 최고 흡광도 를 나타내는 440 nm에서 모든 효소제가 세포배양액 수준 의 낮은 흡광도(0.04–0.06)를 나타내고 있음을 확인하였고, 세포배양액에 Table 1과 같이 설정된 최고 농도로 준비 시 급격한 pH 변화(7.6-8.4)를 유발하지 않는 것을 확인하였 다. 효소제에 의한 세포성장 저해 및 사멸에 미치는 영향 을 WST-1 분석법을 이용하여 평가한 결과, 모든 효소제가 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(p<0.05, Fig. 1). 이는 native나 inactivated 효소제, 다른 제조기원 및 형태의 효소 제 모두 세포성장 저해 및 사멸을 유발하는 않음을 제시한 다. 또한 세포시험에 사용된 최고 농도는 효소제의 가공식 품에서의 최고사용량, 일일섭취량, 소장액 부피 및 소장 체 류시간 등을 모두 고려하여 설정한 것임으로 실질적 노출 조건에서 세포독성이 낮음을 의미한다 할 수 있다.

Fig. 1. Effect of 7 kinds of food additive enzymes in (A) native and (B) inactivated forms on cell proliferation of Caco-2 cells. Two-fold serial dilutions from the highest concentrations were carried out for each enzyme. The highest concentrations of natural food additive enzymes were presented in Table 1. No significant differences were found among enzymes-treated samples and untreated control cells (p>0.05).

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다빈도로 사용되는 효소제 7종에 의한 세포막 손상 유발 여부는 세포 내 존재하는 젖산탈수소효소(LDH)가 세포막 손상에 따라 배양액으로 유출되는 정도를 측정하여 확인하 였다(Bae et al., 2018). 또한 젖산탈수소효소 용출은 세포 막 손상에 의해 세포가 사멸되었음을 의미하는 분석 지표 로 이용되기도 한다(Chan et al., 2013). 그 결과, native나 inactivated 효소제 모두 젖산탈수소효소를 세포 배양액으로 유의미하게 용출시키지 않는 것으로 나타났다(p<0.05, Fig. 2). 즉, WST-1 결과(Fig. 1)와 젖산탈수소효소 분석 결과 (Fig. 2)를 종합하면, native와 inactivated 효소제 모두 세포 성장 저해 및 세포막 손상에 의한 세포사멸을 유발하지 않 는 것으로 보여지며 이러한 결과는 세포독성이 낮음을 제 시한다.

Fig. 2. Effect of 7 kinds of food additive enzymes in (A) native and (B) inactivated forms on LDH release from Caco-2 cells. LDH release was performed at 5 concentrations by two-fold serial dilutions from the highest concentration as shown in Table 1. No significant differences were found among enzymes-treated samples and untreated control cells (p > 0.05).

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세포 내 활성산소종(ROS) 생성은 산화스트레스 유발의 지표로 이용되며, 이는 세포막 투과성 비형광 물질인 H₂DCFDA가 세포 내 esterase에 의해 탈아세틸화된 후 ROS와 반응하여 생성되는 DCF의 형광을 측정하여 분석 할 수 있다(Zhao et al., 2010). Fig. 3A에서 보듯이 native 효소제 중 종국 3종(SM-1, SM-2, SM-3)에 의한 ROS 생 성이 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났고(p<0.05), 그 외 6종 효소제에 의한 ROS 증가는 유의적으로 나타나 지 않았다(p>0.05). 이러한 결과는 일부 native 효소제가 식품에 그대로 잔존 시 ROS 유발 가능성을 제시한다 할 수 있으며, 연구에 사용한 종국 3종에서 모두 ROS가 유발 된 점을 감안하면 효소 자체에 의한 영향이거나 종국 생성 과정에서의 대사 및 발효산물 등 부산물과 관련이 있을 것 으로 보인다(Lee et al., 2014). 종국으로 사용되는 균주인 Aspergillus 속은 다양한 대사산물을 생성하는 것으로 알려 졌으며(Frisvad et al., 2018), 2차 대사산물 중 kojic acid는 ROS를 유발하는 것으로 보고된 바 있다(Rodrigues et al., 2011). 그러나, Aspergillus 속 생산 효소제인 P-1, K-1과 K-2에 의한 ROS는 유의적으로 증가하지 않아 효소 자체 에 의한 영향도 있는 것으로 보이며, inactivated 효소제는 모두 ROS를 유발하지 않는 것으로 나타나(Fig. 3B) 실질 적으로 가공제품에 잔존하는 불활성화된 효소제에 의한 ROS 생성 가능성은 낮을 것으로 보여진다.

Fig. 3. Effect of 7 kinds of food additive enzymes in (A) native and (B) inactivated forms on intracellular ROS generation in Caco-2 cells. Two-fold serial dilutions from the highest concentrations were carried out for each enzyme. The highest concentrations of natural food additive enzymes were presented in Table 1. Different lowercase letters (a, b, c, d, and e) indicate significant differences among enzymes-treated samples and untreated control cells (p<0.05).

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2018년 식품첨가물의 기준 및 규격 일부개정고시에 따라 식품첨가물 가공보조제로 효소제의 사용허가를 위해서는 독성자료로서 면역독성시험(알레르기원성) 자료가 요구된다 (MFDS, 2021c). 본 연구에서는 세포수준에서 알레르기원 성 평가방법으로 RBL-2H3 세포에서 β-hexosaminidase의 용출 정도를 확인하였다. RBL-2H3 세포는 흰쥐의 호염기 성 백혈병 세포로서 알레르기 반응을 측정하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 세포이다(Chung et al., 2011). 면역 반응에 의해 분비되는 히스타민은 세포에서 농도가 매우 낮기 때문에 분석 결과에서의 편차가 큰 단점이 있는 반 면, β-hexosaminidase는 세포 내 높은 농도로 존재할 뿐 만 아니라 히스타민 탈 과립 시 함께 세포 밖으로 용출되 는 물질로서 배양액에서 β-hexosaminidase 활성 측정은 탈 과립의 지표로 이용될 수 있다(Choi., 2002). 양성대조 군으로서 C48/80을 사용하였는데, 이는 N-methyl-p-methoxyphenethylamine과 formaldehyde의 축합에 의해 생성된 중합체로서, 히스타민 방출을 촉진하고 비만세포 및 호염 기성 세포에서의 탈 과립을 촉진하는 물질로 사용된다 (Shipstone et al., 1999). 그 결과, 종국 1종(백국)과 프로테 아제 1종(곰팡이성)의 native 효소제가 β-hexosaminidase를 농도 의존적으로 세포 밖으로 용출시키는 것으로 분석되었 다(Fig. 4A). Aspergillus 속 기원의 곰팡이성 효소제가 알 레르기원으로 작용하며, 면역 반응을 유발할 수 있는 것으 로 보고된 바 있다(Shen et al., 2007;Balenga et al., 2015;Onami et al., 2019). 그러나 Aspergillus 속 기원의 다른 효소제나 다른 미생물에서 유래된 효소제에 의한 β- hexosaminidase 용출이 나타나지 않은 결과는 같은 효소 제의 경우에도 기원에 따라서 탈과립화에 의한 알레르기 원성 영향이 달라질 수 있음을 제시한다. 이는 효소제 자 체에 의한 영향보다는 미생물 기원에 따른 효소제 생성과 정에서 미량 잔류하는 대사 및 발효산물에 의한 영향으로 보여지며, 이를 뒷받침하기 위한 연구가 추후 요구된다. 그 러나, 열처리에 의한 모든 inactivated 효소제들의 경우 β- hexosaminidase를 용출시키지 않는 것으로 나타났다(Fig. 4B). 이는 양성대조군으로 사용한 C48/80에 의한 β- hexosaminidase의 용출이 확연히 나타난 것과 대조되는 결 과이다. 일반적으로 단백질이나 효소의 경우 면역반응에 의한 독성을 나타낼 수 있는 것으로 알려져 있으나(Merget et al., 1993;Bannon, 2004), 식품첨가물 가공보조제로 사 용되는 효소제의 경우 가공과정에서 사용된 후 최종제품에 불활성화되거나 제거되는 경우가 많으며, 특히 가공과정에 서 대부분 불활성화되기 때문에 알레르기원성으로의 독성 이 낮은 것으로 보고된 바 있다(Paschke, 2009;FSCJ, 2017). 본 연구 결과는 일부 native 효소제의 경우 탈 과 립화를 유발할 수 있는 것으로 보여지나, 최종 제품에서 불활성화된 형태의 효소제에 의한 알레르기원성 독성이 낮음을 제시하고 있다(Sewalt et al., 2018). 또한, 본 실험 은 국민영양통계분류 기준 효소제가 첨가되는 대분류 내 세부 식품항목의 총합으로 일일섭취량을 도출하여 세포독 성시험 최고 농도를 설정하였는데, 이와 같이 효소제들이 첨가된 세부 식품항목을 하루 동안 모두 섭취할 가능성은 극히 낮으므로 실질적 독성영향은 더욱 낮을 것으로 판단 된다.

Fig. 4. Effect of 7 kinds of food additive enzymes in (A) native and (B) inactivated forms on β-hexosaminidase release from RBL-2H3 cells. β-hexosaminidase release was performed at 6 concentrations by two-fold serial dilutions from the highest concentration as shown in Table 1. Different lowercase letters (a, b, c, d, e, and f) indicate significant differences among enzymes-treated samples and untreated control cells (p<0.05).

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