단백질분해효소에 의한 쌀가루로부터 쌀전분의 분리 및 물리화학적 특성

경기도 김포 지역에서 2017년도에 재배되어 2018년에 도정된 멥쌀(백미)을 시중에서 구입하여 쌀전분 분리를 위한 원료로 사용하였다. 식품첨가물 등급의 protease (Alphalase NP, minimum 1,600 AZO/g, from Bacillus amyloliquefaciens, 최적반응온도 60°C, 최적 pH 6.5)는 (주)비전바이오켐 (BISION Co., Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 이외 쌀전 분의 분리 및 특성 평가에 사용된 용매 및 시약들은 ACS 등급 이상의 것을 사용하였다.

멥쌀은 과량의 수돗물로 3회 세척하고 멥쌀 무게의 3배 가량의 탈이온수를 가하여 상온(~24°C)에서 3시간 동안 침 지한 후 체반에서 30분간 탈수하였다. 수화된 멥쌀은 롤 간 격을 5 mm, 3 mm와 1 mm로 조정된 롤밀(DK104, Sdjung Tech, Daegu, Korea)를 순차적으로 통과시키면서 분쇄하였 다. 습식제분된 쌀가루는 적외선수분측정기(LP16, Mettler- Toledo AG, Greifensee, Switzerland)를 이용하여 수분함량 을 측정하고 폴리프로필렌 지퍼백에 넣어 -45°C에서 48시 간 동안 동결한 후 -20°C에서 저장하면서 쌀전분 제조에 사용하였다.

쌀전분의 효소적 분리 조건은 protease의 반응시간(8-24 h), 반응온도(15-40°C)와 효소사용량(0.5-1.5%, d.b)을 요인 들로 하여 반복점들과 중심점들(5개)을 포함시키는 변형된 23 완전요인설계법에 따라 21개의 실험점들을 도출하였다. 각 처리요인들의 수준을 -1, 0, 1로 부호화된(coded) 값과 실제값을 Table 1에 나타내었다. 반응변수(response)는 도출 된 protease 반응조건에 따라 제조된 쌀전분의 분리수율로 하였다.

Table 1. Modified 2³ factorial design matrix and response¹⁾ for the yield of starches isolated from the frozen rice flour by foodgrade protease

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동결된 쌀가루(100 g)를 탈이온수(300 mL)와 혼합하고 반응온도에 도달할 때까지 가온하면서 교반하였다. 이후 protease를 가하여 반응시간 동안 반응온도를 유지하면서 교반하였다. 효소반응이 완료된 후 효소반응물을 400 mesh 표준체망(No. 400, Chunggye; Seoul, Korea)을 통과 시켜 전분 유를 분리하였다. 회수된 전분 유는 원심분리 (100 g, 20 min)하여 상층액과 침전물을 분리한 후 침전물 상층부의 단백질(밝은 노란색 층 또는 회백색 층)을 시약 스푼을 이용하여 조심스럽게 긁어(scraping) 제거하였다. 단 백질이 제거된 침전물은 과량의 탈이온수를 가하여 분산시 키고 상온에서 10분간 교반한 후 원심분리(100 g, 20 min) 하였다. 이와 같은 일련의 과정은 침전물의 상층부에서 단 백질이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 3~6회 반복하였다. 최종적으로 회수한 침전물은 무수에탄올을 가하여 분산시 키고 상온에서 30분간 교반한 후 감압여과하고 50°C에서 24 h 동안 열풍건조하여 쌀전분을 제조하였다. 한편 효소 적 분리법에 의한 쌀전분의 대조군은 동일한 쌀가루를 원 료로 하여 알칼리 침지법(Wang & Wang, 2004)에 의해 제 조된 쌀전분으로 하였다. 제조된 쌀전분의 수율은 아래의 계산식에 의해 결정하였다.

쌀전분들의 총 전분 함량은 AACC법 73-13에 따라 total starch assay kit (Megazyme Int., Wicklow, Ireland)를 이용 하여 측정하였다(AACC, 2000). 아밀로오스 함량은 Chrastil (1987)에 따른 비색법을 이용하여 분석하였다. 효소적 분리 법에 의해 얻은 쌀전분의 상대적 순도(relative purity)는 다 음의 계산식에 의해 결정되었다.

쌀전분(0.5 g, d.b)을 탈이온수(25 mL)와 원심분리관에서 혼합한 후 85°C의 항온수욕조에서 5분 간격으로 vortexing 하면서 총 30분간 가열하고, 냉수욕조에서 20분간 냉각시 켰다. 냉각된 쌀전분 페이스트는 원심분리(3,000 g, 20 min)하여 침전물과 상층액으로 분리하였다. 상층액은 정용 플라스크로 옮기고 탈이온수를 가하여 100 mL로 정용하였 으며, 희석된 상층액은 페놀-황산법을 통해 총 당 함량을 측정하여 용해도를 아래의 계산식에 의해 결정하였다. 팽 윤력은 원심분리 후 회수된 침전물의 무게를 측정하여 아 래의 계산식에 따라 산출하였다(Kim & Kim, 2015).

용해도 계산식의 0.9는 포도당의 몰 질량(180 g/mol)에 대한 무수포도당(anhydrous glucose unit)의 몰 질량(162 g/ mol)의 비율이다.

쌀전분의 호화특성은 시차주사열량계(DSC 4000, Perkin- Elmer Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 분석하였다 (Kim et al., 2013). 쌀전분(5 mg, d.b)을 스테인리스강 팬에 정밀하게 칭량하고 총 20 mg이 되도록 탈이온수를 가하여 기계적으로 밀봉한 후 상온(~24°C)에서 18 h 동안 방치하 였다. 제조된 팬은 시차주사열량계를 사용하여 25~100°C까 지 5 °C/min의 가열속도로 스캔하여 DSC thermogram을 얻었다. Pyris software (version 11.1.0.04.88, PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하여 호화온도와 호화엔 탈피를 결정하였다.

쌀전분의 페이스팅 점도 특성은 신속점도분석기(RVA- 3D, Newport Scientific, New South Wales, Australia)를 사 용하여 분석하였다. 쌀전분(2 g, d.b)을 알루미늄 용기에 직 접 칭량하고 탈이온수를 가하여 총 28 g으로 한 후 시약스 푼과 플라스틱 회전축을 이용하여 완전히 분산시켰다. 제 조된 분석시료는 신속점도분석기를 이용하여 미리 결정된 온도 프로파일에 따라 160 rpm으로 플라스틱 회전축을 회 전시키며 페이스팅 점도변화를 조사하였다. 온도 프로파일 은 초기 2분간 50°C로 온도를 유지시킨 후 95°C까지 12 °C/min의 가열속도로 95°C까지 온도를 상승시켜 95°C에서 2분 30초간 유지하였고, 이 후 12 °C/min의 냉각속도로 50°C까지 온도를 낮춰 50°C에서 2분간 유지하여 총 14분 에 걸친 페이스팅 점도 프로파일을 얻었다.

설계된 반응조건에 따라 쌀전분은 3회 반복하여 제조하 여 수율을 결정하였다. 쌀전분의 수율들의 평균값들은 Design Expert (version 7, Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 요인분산분석을 수행하였고, 주요인들과 이들의 교호작용들의 유의성을 95% 신뢰수준에서 검증하 였다. 한편 대조군과 선별된 쌀전분들의 물리화학적 특성 들은 3회 반복하여 분석하였고, 일원분산분석(one-way ANOVA)을 수행하여 평균±표준편차로 나타내었다. 분석된 특성치들의 평균값들 사이의 통계적 유의성은 Tukey’s HSD multiple range test를 이용하여 95% 신뢰수준에서 검 증하였다. 쌀전분들의 통계적 계산과 분석은 Minitab 18 (Minitab Inc., State College, PA, USA)를 이용하였다.

변형된 2³ 완전요인설계법에 의해 도출된 protease 반응 조건들에 따라 제조된 쌀전분의 수율을 Table 1에 나타내 었다. 쌀전분들의 수율은 42.7-52.9%의 범위에 있었으며, 쌀가루의 건물량 대비 0.5%의 protease를 가하여 15°C에서 8시간 동안 효소반응을 통해 제조한 경우(Run 8)가 52.9% 로 가장 높은 수율을 나타내었다(Table 1). 그러나 모든 protease 반응조건들에 의해 제조된 쌀전분들의 수율은 알 칼리 침지법에 의한 것(대조군, 61.8%)보다 낮은 수율을 나타내었다. 이는 본 연구에서 사용된 protease의 최적 pH 가 6.5로 중성에 가깝기 때문으로 생각된다(Wang & Wang, 2001). Wang & Wang (2001)은 산성 및 알칼리 protease (각각 최적 pH 3.0과 9.8)를 사용하여 이들의 최적반응조건 에서 쌀전분을 분리한 경우 알칼리 침지법에 의한 쌀전분 의 수율과 유사하거나 유의적으로 높았으나, 중성 protease (최적 pH 7.5)의 경우에는 유의적으로 낮은 수율을 보고하 였다.

효소적 분리·정제법에 의한 쌀전분의 수율에 대한 protease 반응조건들의 영향을 조사하기 위해 Table 1의 결 과를 이용하여 요인분산분석을 수행하였다(Table 2). 쌀전 분의 수율에 반응온도와 protease 사용량은 유의적이었으나 (p<0.05), 반응시간은 유의적인 영향을 미치지 않았다 (p>0.05; Table 2). 그럼에도 반응시간과 반응온도, 반응시 간과 protease 사용량, 반응온도와 protease 사용량의 교호 작용들은 모두 쌀전분의 수율에 유의적이었다(p<0.05; Table 2). 주요인들의 교호작용을 설명하는 반응표면 plot들 에 의하면, 쌀전분의 수율은 주어진 반응시간에서 반응온 도가 낮아질수록 증가하였으나, 30-40°C의 반응온도 범위 에서는 반응시간이 연장될수록 감소하는 경향을 나타내었 다(Fig. 1A). 또한 반응시간이 짧아질수록, protease 사용량 이 적어질수록 쌀전분의 수율은 증가하였고(Fig. 1B), 주어 진 반응온도에서 protease 사용량이 증가할수록 쌀전분의 수율은 감소하였다(Fig. 1C). 따라서 쌀가루로부터 protease 처리를 통해 쌀전분을 분리할 때, 반응온도는 낮을수록, 반 응시간은 짧을수록, protease 사용량은 적을수록 쌀전분의 수율이 증가하는 것으로 추정된다. 이러한 해석은 본 연구 에 사용된 protease가 Bacillus 속의 세균으로부터 분리된 것으로 amylase 계통의 전분분해효소들이 미량 함유되어 있기 때문인 것으로 판단된다. 본 연구에 사용한 protease 의 amylase 활성을 0.1% soluble starch 용액에 protease를 가하여 40°C에서 30분간 가열하여 생성된 환원당의 양으 로 결정하였을 때(Aquino et al., 2003), 5.4 U/mL (1 unit은 단위 시간(min)당 1 μmol의 환원당을 생성하는 효소양으로 정의)이었다. 한편 효소적 분리·정제법에 의한 쌀전분들 이 알칼리 침지법에 의한 것(대조군)의 물리화학적 특성에 상응하는지를 비교하기 위하여 본 연구에서 50% 이상 수 율을 보이는 protease 반응조건들에 의해 제조된 쌀전분들 을 선별하여 물리화학적 특성을 비교하였다. 선별된 쌀전 분들은 Table 1에 제시된 조건들 중 0.5% protease를 이용 하여 15°C에서 8시간 동안 분리한 것(Run 8과 15; RST1), 1.5% protease를 이용하여 15°C에서 24시간 동안 분리한 것(Run 11과 17; RST2)과 0.5% protease를 이용하여 15°C 에서 24시간 동안 분리한 것(Run 4와 13; RST3)들이었다.

Table 2. ANOVA (analysis of variance) for the effects of factors and interactions on the yield of starches isolated from the frozen rice flour

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Fig. 1. Response surface plots describing the effects of the interactions among time, temperature and protease loading on the yield of starches isolated from the frozen rice flours by food-grade protease.

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선별된 쌀전분들의 상대적 순도는 대조군(알칼리침지법 에 의해 제조된 쌀전분)에 대한 효소적 분리·정제법에 의 한 쌀전분의 총 전분 함량의 백분비율로 나타내었다(Table 3). RST1, RST2와 RST3의 상대적 순도는 각각 102.5, 102.9, 100.9%이었고(Table 3), 이러한 결과는 효소적 분 리·정제법에 의한 쌀전분들이 대조군보다 높은 순도를 가 진다는 것을 의미한다. 한편 아밀로오스 함량에 있어 대조 군은 19.8%, RST1은 18.4%, RST2는 20.1%, RST3는 18.9%이었다(Table 3). 대조군과 선별된 쌀전분들 사이의 아밀로오스 함량의 차이는 미미한 수준이었으나, 통계적으 로 대조군에 비해 RST2는 유의적이지 않았고 RST1과 RST3는 유의적으로 낮았다. 이것은 protease에 함유되어 있는 미량의 amylase 계통의 효소들에 의해 쌀전분들이 분 리되는 동안 미미하게 손상된 결과인 것으로 생각된다.

Table 3. Mean¹⁾ values for the relative purity, amylose content, solubility, and swelling power of starches isolated from the frozen rice flour by alkaline steeping and enzymatic methods

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대조군과 선별된 쌀전분들의 용해도와 팽윤력을 조사하 여 Table 3에 제시하였다. 용해도는 RST1, RST2와 RST3 가 각각 16.5, 9.1과 10.2%로 대조군(4.8%)에 비해 유의적 으로 높은 수준을 나타내었다(Table 3). Protease에 미량 함 유되어 있는 amylase 계통의 효소들에 의해 쌀전분 입자들 의 부분적인 손상으로 팽윤된 전분입자들로부터 전분분자 들의 침출(leaching)이 빈번하게 일어난 결과인 것으로 판 단된다(Evers & Stevens, 1985;Srichungwong et al., 2005). 한편 팽윤력은 RST1 (14.7 g/g)의 경우 대조군(12.6 g/g)에 비해 유의적으로 높은 수준을 나타내었지만, RST2 (12.7 g/g)와 RST3 (12.7 g/g)는 유의적인 차이를 나타내지 않았 다(Table 3). 전분입자의 팽윤은 아밀로펙틴의 역할이며, 아밀로오스의 증가와 함께 억제된다고 알려져 있다(Tester & Morrison, 1990). 또한 전분입자 미소결정의 완전성 (perfection) 및 안정성(stability)이 높을수록 전분입자의 팽 윤은 제한된다고 보고되었다(Srichungwong et al., 2005). Evers & Stevens (1985)은 전분의 용해도가 높을수록 팽윤 력은 감소한다고 하였다. 그러나 본 연구에서 분석된 팽윤 력은 쌀전분의 용해도를 고려하여 결정되었기 때문에 팽윤 력에 대한 용해도 차이의 영향은 배제하였다. 따라서 대조 군에 비해 RST1의 팽윤력이 유의적으로 높은 것은 RST1 의 아밀로오스 함량이 대조군에 비해 유의적으로 낮으며 (Table 3), RST1의 미소결정이 protease 처리 동안 부분적 으로 손상되었기 때문으로 생각된다. 게다가 RST2와 RST3는 장시간의 반응시간을 거쳐 제조되면서 annealing 현상에 의해 대조군이나 RST1에 비해 낮은 팽윤력을 나타 낸 것으로 판단된다(Zavareze & Dias, 2011). 한편 아밀로 오스 함량이 RST1과 유사한 RST3의 팽윤력이 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않는 것은 RST3 내 미소결정들의 완전성과 안정성이 protease 처리하는 동안 향상되었음을 암시하며, 이로 인해 대조군에 비해 낮은 아밀로오스 함량 의 영향이 상쇄되었기 때문으로 생각된다.

대조군과 선별된 쌀전분들의 호화온도와 호화엔탈피를 시차주사열량계로 분석하여 Table 4에 나타내었다. 효소적 분리·정제법에 의한 쌀전분들(RST1, RST2와 RST3)의 호화개시온도는 54.4-55.7°C, 호화최고온도는 62.9-63.7°C, 호화종결온도는 72.4-72.8°C의 범위에 있었으며, 모든 호 화온도들이 대조군에 비해 유의적으로 높았다(Table 4). 전분의 호화온도는 미소결정의 완전성을 설명하며(Tester & Morrison, 1990), 호화온도가 높을수록(Zhou et al., 2010), 호화온도범위(호화개시온도와 호화종결온도의 차)가 좁을수록(Tester & Morrison, 1990) 미소결정의 완전성은 향상된다고 알려져 있다. 본 연구에서 RST1, RST2와 RST3의 호화온도범위는 각각 18.4°C, 16.9°C와 17.0°C이었 으며, RST1을 제외하고 대조군(17.8°C)보다 낮은 수준을 나타내었다. 그래서 RST1은 대조군보다 호화온도가 미미 하지만 유의적으로 상승하였음에도 RST1의 미소결정은 protease 처리 동안 부분적으로 손상된 것으로 생각되며, 이 는 RST1의 높은 팽윤력(Table 3)에 대한 해석을 지지하는 것으로 판단된다. 반면 RST2와 RST3의 호화온도범위가 대조군보다 적은 것은 protease 처리(15°C, 24 h)에 의해 쌀전분을 분리하는 동안 annealing이 진행된 결과인 것으 로 추정된다. Zavareze & Dias (2011)은 annealing은 전분 의 호화개시온도와 호화최고온도를 상승시키고 좁은 호화 온도범위를 유발시킨다고 하였다. 한편 호화엔탈피는 대조 군(15.5 J/g)에 비해 선별된 쌀전분들(12.9-14.5 J/g)이 유의 적으로 낮은 수준을 나타내었다. Tester & Morrison (1990) 은 전분의 미소결정의 양은 호화엔탈피와 직접적으로 비례 한다고 하였다. Zavareze & Dias (2011)은 annealing은 전 분의 호화엔탈피에 있어 영향을 미치지 않거나 상승시킨다 고 하였다. 그럼에도 본 연구에서 선별된 쌀전분들이 대조 군에 비해 낮은 호화엔탈피를 보인 것은 protease 처리를 통해 쌀전분을 분리하는 과정 중 annealing에 의해 미소결 정들의 완전성(또는 안정성)이 향상되는 동시에 protease의 amylase 계통 효소들에 의해 불완전한 미소결정들이 부분 적으로 손상된 것으로 생각된다.

Table 4. Mean¹⁾ values for gelatinization temperature and enthalpy of starches isolated from the frozen rice flour by alkaline steeping and enzymatic methods

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신속점도분석기를 이용하여 대조군과 선별된 쌀전분들의 페이스팅 점도 특성을 조사하였다(Fig. 2). 대조군의 페이 스팅 점도 프로파일은 전형적인 쌀전분의 것과 유사하였다 (Srichungwong et al., 2005). 그러나 효소적 분리·추출법 에 의한 쌀전분들은 대조군에 비해 페이스팅 점도가 모든 온도프로파일에 있어 낮은 수준을 나타내었다. 게다가 α- amylase와 amyloglucosidase에 의해 제조된 다공성 옥수수전 분의 페이스팅 점도 특성과 유사하였다(Zhao et al., 2018). 따라서 선별된 쌀전분의 페이스팅 점도 특성은 본 연구에 서 사용된 protease에 함유되어 있는 미량의 amylase 계통 효소들에 의해 쌀전분을 분리하는 동안 쌀전분 입자가 부 분적으로 손상되었기 때문인 것으로 생각된다.

Fig. 2. Pasting viscosity profiles of starches isolated from the frozen rice flour. A control indicates a rice starch isolated from the frozen rice flour by an alkaline steeping method. RST1, RST2, and RST3 corresponded to rice starches isolated from the frozen rice flour by enzyme reactions for 8 h at 15°C with 0.5% protease, for 24 h at 15°C with 1.5% protease, and for 24 h at 15°C with 0.5% protease, respectively.

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