간세포 독성과 에탄올 대사에서 추출 조건에 따른 다슬기 추출물의 효과

본 실험에서 사용된 다슬기는 ㈜정옥(Hadong, Korea)에 서 제공받아 사용하였다. 추출물은 다슬기 과육 100 g에 대 하여 5배수의 용매(증류수)를 첨가하여 water bath (JSEB- 60T; JS Research Ich, Gongju, Korea)에서 추출하였다. 대 조군인 열수추출물은 97°C에서 1시간 추출하였고, 효소추 출물은 alcalase 2.4L 0.5%을 첨가하여 60°C에서 각각 1, 3, 5시간 추출하였다. 또한, 산추출물은 용매로 2 N HCl을 사용하여 1, 3, 5시간 추출하였으며, 효소-산추출물은 alcalase 2.4 L 0.5%을 첨가하여 60°C에서 3시간 추출 후 동량의 2 N HCl을 첨가하여 1, 3, 5시간 추출하였다. 이들 추출물은 80 mesh체로 슬러지를 제거하여 여과지(whatman No. 2)로 여과한 후 감압농축기(Loborota 20 Control; Heidolph, Schwabach, Germany)로 농축하여 동결 건조한 후 4°C로 보관하면서 실험에 사용하였다.

시료 0.1 g에 증류수 10 mL을 첨가하여 추출한 후 여과 하고 여과액에 5-sulfosalicylic acid dihydrate를 1 mL 가한 후 4°C 냉장고에서 24시간 동안 방치하여 단백질을 침전 시켰다. 이들 시료는 4,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 40°C 이하에서 감압농축기(Eyela N-1100V-W; Tokyo Rikakikai Co. Ltd, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축 시킨 후 0.2M의 lithium citrate loading buffer (pH 2.2)를 5mL 첨가하여 용해하고, 0.2 membrane filter로 여과하여 130 μL를 아미노산분석기(S7130 Amino acid reagent organizer; Sykam Co. Ltd., Gilching, Germany)로 분석하 였고, UV/VIS detector 400 nm (1.00 AU)와 570 nm (1.00 AU)로 검출하였다.

DPPH 라디칼 소거활성은 Blois 방법(Blois, 1958)에 따 라 측정하였다. 0.01% DPPH-methanol 용액에 동량의 시 료 추출물을 혼합하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH 라디칼 소거 활성은 시 료 무첨가군에 대한 시료 첨가군의 흡광도 비율(%)로 나 타내었다. 양성대조군은 ascorbic acid (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.

ABTS 라디칼 소거능 측정은 Re et al. (1999)의 방법에 따라, 7 mM ABTs 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM 이 되도록 용해시켜 암실에서 12-16시간 동안 반응시킨 후 414 nm에서 흡광도 값이 약 1.5가 되도록 증류수로 조정하 여 사용하였다. 조정된 ABTS 용액에 각 시료 추출원액을 1mL씩 가하여 10초간 잘 혼합한 다음 실온에서 10분간 반응시켜 414 nm에서 흡광도를 측정하였으며, ABTS 라디 칼 소거능은 시료 무첨가군에 대한 시료 첨가군의 흡광도 비율(%)로 나타내었다. 양성대조군은 trolox (Calbiochem, Darmstadt, Germany)를 사용하였다.

인간 간암 세포인 HepG2 세포는 10% (v/v) Fetal Bovine Serum (FBS; Gibco, Carlsbad, CA, USA), 1% (v/v) penicillinstreptomycin (Gibco)을 첨가한 RPMI-1640 배지(Gibco)로 37°C, 5% CO₂가 유지되도록 배양하였다. 배양된 세포는 2-3일 간격으로 계대 배양하여 실험에 사용하였다. 세포생 존율을 측정하기 위하여 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan)을 사용하여 아세트아미노펜 (acetaminophen, AAP) (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA)을 통한 간세포 독성 유도 실험을 수행하였다. 즉 96-well plate에 세포 농도 1×10⁴ cells/well로 분주한 다음 세포부착을 위해 24시간 배양한 후 AAP와 다양한 조건으 로 추출된 다슬기 추출물을 처리하여 세포생존율을 확인하 였다. 또한, 세포독성 측정을 위한 실험으로 세포가 괴사 (necrosis)를 일으키면 LDH의 분비가 증가되는 것을 이용하 였다. HepG2 세포를 상기와 같은 조건으로 배양한 후 LDH 활성 측정은 EZ-LDH Cytotoxicity assay kit (DoGen, Seoul, Korea)을 사용하여 측정하였다. 원심분리기를 이용 하여 배지 중에 부유해 있는 세포를 침전시키고 상층액을 새로운 96-well plate로 옮기고 LDH 반응액을 제조하여 각 well에 첨가하고 섞어준 다음 상온에서 30분간 반응시 키고 microplate reader (VersaMax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)에서 450 nm 흡광도를 측정하여 세 포독성을 계산하였다.

동물실험을 수행하기 위하여 경상대학교 동물실험윤리위 원회에서 승인(GNU-161004-M0056)을 받았으며, 규정에 따라 동물실험에 관한 윤리 과정을 준수하여 연구를 진행 하였다. 6주령 C57BL/6 마우스에 졸레틸50 (Virbac, Paris, France)과 럼푼(Bayelkorea Co., Seoul, Korea)을 8:2로 섞은 후 10배 희석하여 몸무게에 따라 복강주사로 마취(10 μL/ 10 g)시킨 후 개복하여 간문맥에 주사기 바늘을 삽입하여 고정한 다음, 전관류액을 관류시켜 혈액을 제거한 간조직은 마우스 liver dissociation kit (Miltenyi Biotec, Cambridge, MA, USA)을 사용하여 간세포를 분리하였다. 분리한 간세포 를 William E washing media (Gibco, Carlsbad, CA, USA) 로 2번 수세 후 원심분리하여 세포를 회수한 후 trypan blue 염색액(Gibco)으로 염색하여 살아있는 간세포를 계수하였 다. 분리한 간세포 4×10⁶개를 William E culture media (Gibco)를 포함하는 세포배양접시(10 cm)에 seeding 하고 37°C CO₂ 배양기에서 배양하였다(Shen et al., 2012). 일차 배양한 간세포 추출액을 효소원으로 사용하여 ADH와 ALDH 효소 활성을 측정하였다. ADH는 alcohol dehydrogenase detection kit (Abcam, Cambridge, MA, USA)을 사 용하여 측정하였다. 효소반응액과 다슬기 추출물을 섞어 37°C에서 3분 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정(A₀) 한 이후 kinetic method를 사용하여 37°C에서 5분 간격으 로 30분까지 450 nm에서 흡광도를 측정(A₁)하였다. ΔOD= A₁-A₀ 값을 계산하여 NADH 표준곡선에서 반응시간(ΔT= T₂-T₁) 동안 ADH에 의해 생성된 NADH량 B값을 계산하 고, 다음 식에 대입하여 ADH 활성을 계산하였다.

$\begin{array}{c}\text{ADH activity =\hspace{0.17em}}\left(\text{B/ΔT×V}\right)\text{×sample dilution factor}\\ \text{= nmol/min/mL = mU/mL}\end{array}$

ALDH는 ALDH activity assay kit (Abcam, Cambridge, MA, USA)을 사용하여 상기 ADH 측정 방법과 동일하게 측정하였다.

실험동물은 (주)오리엔트 바이오(Seongnam, Korea)로부 터 구입한 SD계 6주령 흰쥐(180-200 g)를 사용하였다. 동 물은 일정한 온도와 규칙적인 조명이 자동으로 조절되는 동물실에서 사육되었고 사료와 음수가 자유롭게 공급되었 으며 일주일간의 적응기간을 거친 후 본 실험에 사용하였 다. 실험군은 대조군과 투여군으로 크게 나누고, 알코올을 경구투여 하기 전 18시간 동안 절식시켰다. 알코올 경구투 여 1시간 전에 대조군에는 식염수 10 mL/kg을, 투여군에는 다슬기 효소-산추출물을 500 mg/kg 또는 1,000 mg/kg로 경 구투여 하였다. 1시간 뒤 실험 군 모두에 40% 에탄올을 10 mL/kg씩 1회 경구투여 하였다. 시간 경과에 따른 혈중 알코올 농도와 아세트알데히드 농도 변화를 측정하기 위해 알코올 경구투여 1, 2, 4시간 후에 미정맥에서 채혈한 혈 액을 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 혈중 아세트알 데하이드 농도 분석용으로 사용하였다.

Aldehyde의 정량은 aldehyde quantification assay kit (Abcam, Cambridge, MA, USA)를 사용하여 측정하였다. 분리된 혈청(50 μL)에 2× yellow reaction mixture (50 μL) 를 가한 후 실온에서 30분 incubation 후에 나타나는 발색 도를 550 nm에서 측정하였다. 측정된 흡광도를 aldehyde 표준곡선에 대입하여 aldehyde의 농도(μmol)를 측정하였다. 표준곡선은 10 mM aldehyde 표준용액을 1,000, 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0 μM로 희석하여 상기와 동일한 방법으 로 흡광도를 측정하여 작성하였다.

모든 실험은 3회 반복 실시하여 mean±SD 또는 mean±SE 로 나타내었다. 실험군 간의 유의성은 SAS version 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석 (ANOVA)과 Duncan의 다중범위검증(multiple-range test), 및 반복측정자료의 분산분석(repeated measures ANOVA)으 로 유의성 검증(p<0.05)을 실시하였다.

다슬기 열수추출물, 산추추물, 효소추출물, 효소-산추출물 의 유리아미노산 함량을 분석한 결과는 Table 1과 같다. 총 유리아미노산 농도는 추출시간이 증가함에 따라 유의적 으로 증가하는 경향을 보였다. 특히 산추출물의 경우 총 유 리아미노산의 함량은 시간에 따라 각각 12.6717, 21.4334, 24.0384 mg/mL로 1.0253 mg/mL인 열수추출물과 비교하여 12-23배 이상 총 유리아미노산 농도가 증가하였다. 알코올 분해를 촉진하는 아스파라긴산 함량은 1시간 열수추출물과 비교하였을 때 5시간 효소추출물과 효소-산추출물은 각각 약 121배, 103배 증가하였다. 간장의 해독작용을 강화해주 며, 알코올을 분해하는 과정에서 많이 소모되는 비타민 B1 의 흡수를 돕고 체내 독소중화작용을 도와 간장을 보호해 과음에 의한 간 손상을 예방하는 데 탁월한 역할을 하는 글루탐산은 1시간 열수추출물과 비교하여 5시간 산추출물, 효소-산추출물, 효소추출물 순으로 각각 약 34배, 21.5배, 10배의 함량 증가를 보였다. 필수아미노산 중 황 함유 아 미노산인 메티오닌의 함량은 열수추출물과 비교하여 5시간 산추출물에서 약 88배 이상의 함량 증가를 보였다. 지금까 지 아미노산류 중에서 주로 아스파탐산, 아스파라긴, 글리 신 및 글루탐산이 간 보호 효과와 알코올 대사에 관련이 있는 것으로 보고 되었으며(Park, 1993; Iimuro et at., 1996; Yin et al., 1998; Hwang et al., 2004) 또한, 아르기 닌과 메티오닌이 알코올 대사에 관련된 ADH와 ALDH 효 소 활성을 촉진시키는 작용이 있어 숙취해소 효과는 물론 간 보호 효과도 동시에 있을 것으로 시사 되어 진다(Cha et al., 2009).

본 실험에서는 대표적인 활성 산소종인 라디칼에 대한 소거능으로 항산화력을 측정하였다. 보라색을 나타내는 DPPH는 분자 내에 안정한 라디칼을 함유하지만, 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 라디칼이 소거되며 노란빛을 띄게 된다. 이때의 DPPH의 거동은 ·OH와 유사하며, 반응 의 정도는 항산화제의 수소 공여능에 의존한다. 이런 DPPH 라디칼을 이용하여 일정량의 시료 용액과의 반응에 의하여 DPPH 라디칼이 감소하는 정도를 흡광도로 측정하 여 시료의 항산화 활성을 측정하는 방법을 사용하여 다슬 기 열수추출물, 산추추물, 효소추출물, 효소-산추출물의 항 산화능을 비교하였다. 시료의 농도를 1-10 mg/mL으로 조 절하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과를 Table 2에 나타내었다. 추출시간이 증가함에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성 또한 증가하였으며, 산, 효소를 활용하였을 경우 일반 적인 열수추출물보다 높은 항산화 활성을 나타내었다. 특 히, 효소와 산을 모두 사용하여 추출한 경우 시간이 증가 함에 따라 항산화 활성 또한 급격히 증가하였다.

ABTS 라디칼 소거능은 DPPH 방법과 함께 항산화 활성 을 스크리닝 하는데 많이 이용되며 ABTS를 peroxidase, H2O₂와의 반응에 의해 생성된 활성 양이온인 ABTS+가 시 료 중의 항산화성 물질에 의해 제거되어 고유의 청록색의 변화를 흡광도 값으로 나타내어 추출물의 ABTS+ 라디칼 소거 활성을 측정할 수 있다. 추출 조건에 따른 다슬기 추 출물의 ABTS 소거능을 측정한 결과, 열수 추출물이 산이 나 효소를 활용한 추출물보다 비교적 높은 ABTS 라디칼 소거활성을 보였다. 추출 시간의 증가에 따른 항산화능의 증가는 특별히 나타나지 않았으나 추출 조건에 따라 비교 하였을 때 효소를 사용하여 추출한 경우 가장 높은 ABTS 라디칼 소거활성을 확인할 수 있었다(Table 3). 다슬기에 포함된 histidine, carnosine 등의 아미노산이 항산화 활성에 깊이 관여하고 있을 것으로 추정되며(Lee et al., 2010), 또 한, 다슬기는 이끼류, 조류 및 수중 미세부유물질을 주로 섭취하므로 먹이 중에 함유되어 있는 페놀성 항산화 물질 도 항산화 활성에 영향을 미칠 가능성이 있다.

AAP 유도 간세포 생존율 측정에 앞서 HepG2 세포에 대한 다슬기 추출물의 독성을 확인하였다. 산, 효소, 효소- 산 다슬기 추출물의 독성 측정은 각각의 추출물의 최종 농 도가 200, 500 및 1,000 μg/mL가 되도록 배지에 녹여 사 용하였다. 세포의 독성은 시료를 처리하지 않고 배양한 대 조군에 대비한 세포 생존율로 측정하였으며, 모든 다슬기 가수분해물에서 독성은 나타나지 않았다(Table 4). 이와 같 은 결과는 3.5 g/kg body weight/day를 급이하여 3일간 사 육한 마우스 군에서 치사 혹은 독성을 보이지 않은 Jeon et al. (2003)의 보고와 일치한다. AAP는 예비실험을 통해 세포 생존율이 미처리 대조군에 비해 30-40% 사멸되는 농 도가 10 mM임을 확인하였으며 동일 농도에서 HepG2 세 포의 손상을 유도하였다. 시료 무첨가 대조군의 세포 생존 율을 100으로 보았을 때 AAP 만을 처리한 대조군은 67.8±4.3%의 생존율을 보인 반면 다슬기 추출물의 경우 AAP 만을 처리한 대조군에 비해 효소를 이용하여 3시간 과 5시간 추출한 다슬기추출물 1 mg/mL과 AAP를 병용처 리 한 경우 각각 9.7%와 13.7%의 간세포 생존율 증가를 보였다(Fig. 1A). 따라서, 다슬기 효소추출물은 AAP에 의 해 유발된 약물독성에 의한 간 손상에 대한 보호 효과를 가짐을 시사한다. 다음으로 AAP의 세포독성 기전 연구를 위하여 배양액 중에 들어 있는 lactate dehydrogenase (LDH)의 방출량을 측정하였다. Fig. 1B와 같이 AAP 만을 처리한 대조군은 33.7%의 세포독성을 나타낸 반면 다슬기 추출물을 처리한 경우 대조군에 비해 세포독성이 15.4%- 24.4%로 감소되었다. 이는 HepG2 세포에 대한 AAP의 세 포독성은 세포막 손상과 관련이 있으며 다슬기 추출물이 이러한 세포독성으로부터 세포를 보호한다는 것을 알 수 있게 해 주는 결과라고 할 수 있다.

Fig. 1. Effects of S. libertina extracts on the cytotoxicity induced by the treatment of HepG2 cells with acetaminophen (APP). HepG2 cells were pretreated with S. libertina extract (1 mg/mL) prior to the addition of AAP (10 mM). MTT (A) and LDH (B) assays were then performed after 24 h. *p<0.05, significant with respect to APP-alone. ^#p<0.05, vehicle treated control vs all groups.

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추출 조건에 따른 다슬기 추출물의 알코올 분해효능을 확인하기 위해 일차배양한 간세포를 효소원으로 하여 다슬 기 추출물이 알코올 대사 효소계에 미치는 영향을 관찰하 고자 ADH와 ALDH의 활성을 측정하였다. 실험결과는 Fig. 2와 같다. ADH 활성의 경우, 2 N HCl을 사용하여 추 출한 시료를 첨가하였을 때 ADH와 ALDH 효소활성이 추 출 시간에 상관없이 전체적으로 감소하였다. 이는 추출 후 잔존하는 HCl로 인한 알코올 대사효소계 효소의 변성 혹 은 반응액의 pH 변화에 의한 효과로 사료된다. 단백질 분 해효소인 alcalase 0.5%를 사용하여 3시간과 5시간 추출한 효소추출물(3 h)과 효소추출물(5 h)에서 각각 8.41±0.16 mU/ mL, 6.87±0.41 mU/mL로 시료를 넣지 않은 대조군(Vehicle group)과 열수 추출물에 비해 증가하였으며, ALDH의 활성 또한 5.14±0.09 mU/mL, 4.26±0.10 mU/mL로 대조군에 비 해 증가하였다. ADH 활성은 Ca²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ 등과 같은 미네랄 성분에 의해 촉진되는 것이 보고되었다(Magonet et al., 1992). 또한, ADH 활성 촉진에 있어 아미노산 성분들 도 매우 중요한 인자로 작용하는데, 아스파탐산은 NAD⁺의 재생 촉진에 의한 NAD⁺/NADH 비율 증가로 ADH 활성 을 높여 알코올 분해를 촉진시킨다(Park, 1993). 이러한 보 고와 일치하게 Table 1에서 다슬기 효소추출물의 경우 아 스파탐산의 농도가 가장 높았다. 또한 글리신의 농도도 산 추출 방법보다 효소 및 효소-산추출 방법에서 높이 나타났 다. 이러한 결과는 다슬기 효소분해산물이 아세트알데히드 를 아세트산으로 신속히 분해시켜서 숙취해소에 상당한 효 과가 있을 것으로 기대된다. 일반적으로 다슬기는 간기능 개선에 효과가 있는 것으로 알려져 있지만 다슬기류에서 알코올 분해활성을 조사한 연구는 거의 없으며, 숙취해소 에 대한 연구도 주로 열수 추출물로 수행되었다. 효소추출 법에 의한 생리활성 연구가 기존의 열수 추출법보다도 다 슬기의 숙취해소능을 연구하는데 더욱 효과적인 방법인 것 으로 생각된다. ADH와 함께 ALDH의 활성 증가는 숙취 의 원인인 알데히드의 제거에 중요한 역할을 한다. 따라서 다슬기 추출물에 포함되어있는 아미노산 성분 또는 대사물 이 ADH와 ALDH의 활성을 촉진시켜 알코올과 아세트알 데히드를 신속하게 분해시킴으로서 숙취해소에 더욱 효과 가 있을 것으로 예상된다.

Fig. 2. Effects of S. libertina extracts on ADH and ALDH activities from mouse hepatocyte homogenate. Enzyme activities were measured using the methods described in the ‘Materials and Methods’ section. Values are mean±standard deviation. *p<0.05 compared to control.

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혈중 알코올이 분해될 때 생성되는 아세트알데히드는 숙 취의 주된 원인으로 알코올 대사가 빠르게 진행되지 않아 쌓이는 많은 양의 아세트알데히드는 지방간과 간 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 실험동물에 40% 알코올을 투여 후 알코올 대사 중간산물인 아세트알데히드의 농도를 확인한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 숙취유도군(VC)의 아 세트알데히드의 농도는 알코올 투여 1시간에 165.09±29.16 μM로 가장 높은 농도를 나타내었고, 알코올 섭취 후 2시 간과 4시간에 각각 126.80±35.79 μM 108.93±20.89 μM로 시간경과에 따라 점차 감소하였다. 그에 비해 다슬기 효소 추출물 0.5 mg/kg 처리군(T₁)의 경우, 알코올 섭취 후 2시 간과 4시간에 각각 72.92±5.63 μM, 76.48±12.20 μM로 알 코올 투여 후 1시간에 측정한 113.48±17.86 μM에 비해 서 서히 감소하였다. 다슬기 효소추출물 1 mg/kg 처리군(T₂)은 알코올 투여 후 1시간에 85.78±9.59 μM, 2시간에 70.49 ±19.49 μM로 다른 군에 비해 알코올 대사가 빠르게 진행 되었고, 4시간이 지난 후에는 63.90±14.10 μM로 가장 낮 은 농도를 나타내었다. 결과적으로 숙취유도군의 혈중 아 세트알데히드 양이 알코올 섭취 1시간 후부터 서서히 감소 한 반면, 시료를 투여한 군은 숙취유도군에 비해 알코올 섭취 후 빠른 시간에 혈중 아세트알데히드 양이 급격히 감 소하는 양상을 보이는데, 이것은 체내 에탄올이 시료에 의 해 빠르게 분해되어 숙취가 해소된다는 것을 말해준다.

Fig. 3. Effect of S. libertina extract obtained by enzymatic extraction method on blood acetaldehyde levels in drunken rats. SD rats were orally administrated enzymatic extracts from S. libertina before 30 min alcohol treatment. And then collected serum at each time point. VC means only 40% ethanol treated group, T₁ means 500 mg/kg of S. libertina extract treated group, T₂ means 1000 mg/kg of S. libertina extract treated group. Blood samples were analyzed for acetaldehyde as described in the ‘Materials and Methods’ section. Values for blood acetaldehyde are means ± standard error (bars) for each group of 7 SD rats. Test groups were compared with the saline-pretreated vehicle control group (VC) by repeated-measures analysis of variance (ANOVA). Asterisk indicates a significant difference from VC group, *p<0.05.

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