Starch Citrate의 반응성, 저항전분 함량과 페이스팅 점도 특성에 대한 반건조가열 반응조건의 영향

일반옥수수전분(수분함량 11.5%, 아밀로오스 함량 26.5%) 과 찰옥수수전분(수분함량 12.3%, 아밀로오스 함량 0.8%) 은 삼양사(Seoul, Korea)에서 제조된 상업적 제품을 시중에 서 구입하여 추가적인 정제과정 없이 사용하였다. 무수구 연산(citric acid, anhydrous)은 덕산화학(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 이외에 시료제조와 분석에 사용한 시약들은 ACS 등급 이상의 것을 사용하였다.

Starch citrate의 반응효율, 몰치환도와 저항전분 함량에 대한 반건조 가열반응조건들의 영향을 조사하기 위해 2³ 완전요인배치법(2³ full factorial design)에 따라 실험점들이 설계되었다. 예비실험을 통해 결정된 요인들(factors)은 전 분종류(X₁; 찰옥수수전분과 일반옥수수전분), 반응 pH (X₂; 3.5와 5.5)와 반응온도(X₃; 120°C와 150°C)이었으며, 반응 들(responses)은 반응효율, 몰치환도과 저항전분 함량으로 하였다(Table 1).

무수구연산 10 g은 탈이온수 80 g에 용해시키고 1 N NaOH를 가하여 설계된 pH 조건들(Table 1)로 조정한 후 탈이온수를 가하여 구연산 용액을 100 g으로 하였다. 구연 산 용액 100 g과 생전분 100 g (d.b)은 500 mL 비이커 안 에서 혼합하여(무수구연산의 농도는 생전분의 건조중량 대 비 10%) 상온에서 20분간 혼합한 후 스테인레스강 쟁반으 로 옮기고 45°C의 강제순환 열풍건조기(OF-G, Jeio Tech Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 수분함량 7.5% 이하로 건 조하였다. 건조된 생전분-구연산 혼합물은 가정용 믹서기 (HMF-3450S, Hanil Electric, Incheon, Korea)를 이용하여 분쇄하고 50 mesh 표준체망(No. 50, Chunggye, Seoul, Korea)을 통과시켜 starch citrate의 합성을 위한 반응혼합물 을 제조하였다. 반응혼합물은 컨벡션오븐(FO-600M, JEIO TECH Co., Ltd., Daejeon, Korea)을 이용하여 설계된 반응 온도(Table 1)에서 3시간 동안 가열반응을 수행한 후 상온 (~24°C)으로 냉각하였다. 합성된 starch citrate의 일부(약 10 g)는 반응효율을 분석하기 위해 보관하였으며 나머지는 과량의 50% (v/v) 에탄올 수용액 안에 분산시켜 상온에서 10분간 교반하여 감압여과하고 여과지 위의 전분 케이크는 과량의 50% 에탄올 수용액에 다시 분산시켰다. 이 세척조 작은 총 3회 반복하였고 마지막 세척과정에서 얻어진 전분 케이크는 무수에탄올에 분산시켜 상온에서 10분간 교반한 후 감압여과하여 45°C에서 24시간 동안 건조하여 starch citrate를 제조하였다.

세척하지 않은 starch citrate (0.5 g, d.b)는 50% (v/v) 에 탄올 수용액 20 mL에 분산시켜 50°C의 진탕항온수욕조 (BS-31, Jeio Tech Co. Ltd., Daejeon, Korea)에서 200 rpm 으로 20분간 진탕하고 2,500 g에서 20분간 원심분리하였다. 상등액은 100 mL 정용플라스크로 옮기고 침전물은 50% (v/v) 에탄올 수용액 20 mL에 분산시켰다. 이 조작을 총 3 회 반복하여 전분과 반응하지 않은 구연산을 회수하였다. 3회의 회수조작으로부터 얻은 여액들은 탈이온수를 가하여 100 mL로 정용하였다. 정용된 여액(25 mL)에 페놀프탈레인 용액 3방울을 가하고 0.1 N NaOH (F=1.002; Duksan Co., Ansan, Korea) 표준용액으로 적정한 후 0.1 N NaOH의 소 비량을 이용하여 구연산 함량(W₁)을 결정하였다. 또한 공 시험으로 동일한 절차를 거쳐 무처리 반응혼합물의 구연산 함량(W₀)을 결정하였고 아래의 식에 따라 반응효율을 계산 하였다.

Reaction efficiency (%)= W 0 − W 1 W 0 × 100

무수에탄올 150 mL는 5 N HCl 15mL와 혼합하여 에탄 올-HCl 혼합용액을 제조하였다. Starch citrate에 이온결합 된 나트륨염을 제거하기 위해 starch citrate (2 g, d.b)는 에 탄올-HCl 혼합용액(50 mL)에 분산시켜 30분간 상온에서 교반한 후 유리필터 부크너 깔때기(FN1160-011G/G4, Joylab, Seoul, Korea) 위에서 감압여과하여 전분시료를 회 수하였다. 회수된 전분시료는 80% 에탄올 수용액(100 mL) 을 가하여 10분간 상온에서 교반하고 감압여과였다. 이러 한 세척과정은 여액의 pH가 7-7.5가 될 때까지 반복하였다. 마지막 세척과정에서 회수된 전분시료는 무수에탄올 (50 mL)에 분산시켜 상온에서 10분간 교반하고 감압여과하 여 45°C에서 건조하여 몰치환도 측정을 위한 시료로 하였 다. 동일한 절차를 거친 생전분을 공시험을 위한 시료로 하였다(Liu et al., 2012). 제조된 분석시료(1 g, d.b)는 250 mL 삼각플라스크에서 75% 에탄올 수용액(30 mL)과 혼합하여 50°C에서 30분 동안 진탕하고 상온으로 냉각한 후 0.5 N NaOH (10 mL)을 가하여 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 24시간 후 페놀프탈레인용액을 3방울 가하고 0.1 N HCl 표준용액(F=1.002; Duksan Co., Ansan, Korea) 을 이용하여 역적정(back-titration)하고 2시간 동안 상온에 서 방치한 후 추가로 적정하였다. 2차에 걸쳐 소비된 0.1 N HCl의 양으로부터 starch citrate에서 유리된 구연산 함량을 결정하였다. Starch citrate의 무수포도당에 대한 구 연산의 몰수의 비율로 starch citrate의 몰치환도(molar degree of substitution)를 계산하였다(Ma et al., 2008).

Starch citrate의 저항전분 함량은 AACC법(approved method 32-40)에 따라 저항전분함량분석 kit (total resistant starch assay kit, Megazyme Int., Wicklow, Ireland)를 이용 하여 분석하였다(AACC, 2000). Starch citrate의 저항전분 함량에 대한 열 안정성을 조사하기 위해 starch citrate (100 mg, d.b)은 탈이온수 4 mL와 혼합하여 끓는 수욕조 (~96°C)에서 30분간 가열처리한 후 37°C의 진탕수욕조로 옮겨 냉각하고 AACC법에 따라 저항전분 함량을 결정하였 다(AACC, 2000).

생전분과 starch citrate의 페이스팅 특성은 신속점도분석기 (RVA-3D, Newport Scientific, New south wales, Australia) 를 이용하여 조사하였다. 전분시료(2.24 g, d.b)을 알루미늄 용기에 직접 칭량하고 총 28 g이 되도록 탈이온수를 가한 후 spatula와 플라스틱 회전축을 이용하여 전분시료를 완전 하게 분산시켜 분석시료를 제조하였다. 신속점도분석기는 2분간 30°C로 유지하고 95°C까지 6분에 걸쳐 가열하여 95°C에서 5분간 유지시킨 후 50°C까지 5분에 걸쳐 냉각하 고 50°C에서 2분간 유지시켜 페이스팅 점도 프로파일을 얻었다. 플라스틱 회전축은 신속점도분석기가 조작되는 동 안 160 rpm으로 일정하게 회전시켰다.

설계된 반응조건에 따라 starch citrate들은 2회 반복하여 제조하였으며, 분석된 특성들은 각 starch citrate 당 3회 반 복하여 측정하고 평균±표준편차로 나타내었다. 측정된 결 과치들은 요인분산분석을 수행하여, 요인들의 주효과(main effect)와 교호작용(interaction)을 조사하였다. 결과치들의 평 균값들에 대한 통계적 유의성은 95% 신뢰수준에서 Tukey 법을 통해 분석하였다. 모든 통계적 계산과 분석은 Minitab 16 (Minitab Inc., State College, PA, USA)를 이용하여 수 행하였다.

설계된 반응조건에 따라 제조된 starch citrate들의 반응 효율과 몰치환도는 Table 2에, 이들에 대한 요인들(factors) 의 주효과(main effect)와 상호작용효과(interactive effect)를 요인분산분석한 결과는 Table 3에 제시하였다. 반응효율과 관련하여 starch citrate들은 10.8-91.4%의 범위에 있었으며, W2 (찰옥수수전분, pH 3.5, 120°C)가 91.4%로 가장 높았 으나 N2 (일반옥수수전분, pH 3.5, 150°C)의 반응효율 (90.7%)과 유의적인 차이를 보이지 않았다(p<0.05; Table 2). 요인분산분석에 의해 주효과를 분석하였을 때 아밀로오 스 함량(전분종류)이 증가하면서, pH가 감소하면서, 반응온 도가 증가하면서 반응효율은 유의적으로 증가하였다 (p<0.01; Table 3). 모든 주요인들이 starch citrate들의 반응 효율에 유의적인 영향을 미쳤지만 pH (-34.8)와 반응온도 (34.2)가 전분종류(8.2)에 비해 반응효율의 증가에 더 큰 공 헌을 하였다(Table 3). 한편 전분종류-pH 및 pH-반응온도 가 반응효율의 증가에 유의적인 상호작용(p<0.01)을 하였 으며 그 효과는 전분종류-pH가 pH-반응온도보다 더 높았 다(Table 3). 그러나 전분종류와 반응온도 사이에서는 반응 효율에 대한 상호연계성이 관찰되지 않았다(p>0.05). 따라 서 생전분과 구연산 사이의 에스테르 반응의 반응효율 변 화에 영향을 미치는 주요인자로 pH와 반응온도 이외에 전 분종류도 추가되어야 할 것이다.

Starch citrate의 몰치환도는 0.001-0.039의 범위를 나타내 었고, W2 (찰옥수수전분, pH 3.5, 150°C)가 가장 높은 몰 치환도(0.039)를 나타내었다(Table 2). 몰치환도에 대해 전 분종류의 영향과 관련하여 찰옥수수전분이 일반옥수수전분 보다 높은 치환도를 나타낸 Xie & Liu (2004)의 결과와는 달리 본 연구에서는 유의적인 차이를 나타내지 않았다 (p>0.05; Table 3). 이것은 치환도의 측정방법의 차이 때문 으로 Xie & Liu (2004)는 전분분자와 단일 및 이중 에스 테르 결합된 구연산 분자 내의 자유로운 카르복실산과 Cu²⁺ 사이의 이온결합 정도의 차이로부터 치환도를 계산하 였다. 그러나 본 연구는 전분분자와 단일 및 이중 에스테 르 결합된 구연산을 탈에스테르화하여 starch citrate로부터 유리되는 구연산을 정량하여 몰치환도를 측정하여 Xie & Liu (2004)의 결과와 상이한 것으로 생각된다. 한편 pH는 감소할수록, 반응온도는 증가할수록 유의적으로 몰치환도를 증가시켰고(p<0.01; Table 3), 이러한 경향은 선행된 연구 결과와 일치하였다(Xie & Liu, 2004; Jyothi et al., 2007). 또한 반응온도보다는 pH가 starch citrate의 몰치환도의 증 감에 민감하게 영향을 미치는 것으로 분석되었다(Table 3). 주요인들 사이의 모든 상호작용은 starch citrate의 몰치환 도의 증감에 유의적인 영향을 미쳤다(p<0.01). 전분종류- pH와 전분종류-반응온도의 상호작용들은 starch citrate의 몰치환도를 증가시켰지만 pH-반응온도의 상호작용은 반대 의 경향을 나타내었다. 이는 몰치환도의 증가에 대한 pH와 반응온도가 서로 반대의 효과를 나타내고 pH가 반응온도 보다 더 큰 영향을 미치기 때문으로 생각된다(Table 3). 결 과적으로 전분종류 단독으로는 starch citrate의 몰치환도의 증감에 대한 주요한 요인이 아니지만 pH 또는 반응온도와 상호작용을 통해 몰치환도에 영향을 미친다. 따라서 생전 분과 구연산의 에스테르 반응에 있어 전분종류를 중요한 반응조건들 중 하나로 포함되어야 할 것이다.

설계된 반응조건에 따라 제조된 starch citrate들의 저항 전분 함량을 호화 전(uncocked)과 후(cocked)에 측정하여 Table 2에 나타내었다. 제조된 starch citrate들의 호화 전의 저항전분 함량은 13.5-41.9%의 범위에 있었으며, W2가 가 장 높은 저항전분 함량을 나타내었다(Table 2). 호화 후 starch citrate의 저항전분 함량은 10.1-37.7%의 범위에 있었 으며, W2와 N2가 가장 높은 함량을 나타내었다(Table 2). Xie & Liu (2004)가 보고한 것처럼 주어진 반응조건에서 호화 전의 starch citrate들이 호화 후보다 높은 저항전분 함량을 나타내었다. 한편 호화 전후의 starch citrate들의 저 항전분 함량에 대한 주요인들과 이들의 상호작용의 효과는 정도의 차이는 있지만 동일한 경향을 나타내었다(Table 3). 주요인들의 효과와 관련하여 아밀로오스 함량(전분종류)과 반응온도가 증가하면서, pH가 감소하면서 저항전분 함량을 유의적으로 증가시켰으며(p<0.01), 저항전분 함량에 대한 주요인들의 효과는 pH, 반응온도, 전분종류의 순서로 낮아 졌다(Table 3). 주요인들의 상호작용과 관련하여 저항전분 함량은 전분종류-pH 상호작용으로 유의적으로 증가하며(호 화 전: p<0.05; 호화 후: p<0.01), pH-반응온도 상호작용으 로 유의적으로 감소하였다(p<0.01). 저항전분 함량의 증감 에 대한 효과는 pH-반응온도 상호작용이 전분종류-pH 상 호작용보다 약 5.6-7.1배 높았다. 그러나 전분종류와 반응 온도 자체로는 저항전분 함량의 증가에 유의적인 영향을 미쳤음에도 불구하고 이들의 상호작용은 저항전분 함량의 증감에 유의적인 영향을 미치지 않았다. 따라서 전분종류 와 pH가 저항전분을 목적으로 starch citrate를 제조할 경우 의 주요한 반응조건인 것으로 생각된다.

Starch citrate들의 페이스팅 점도 프로파일은 Fig. 1에 제 시하였다. 찰옥수수전분을 이용하여 제조한 starch citrate들 에 있어 W2 (pH 3.5, 150°C)은 페이스팅 점도를 발달시키 지 못했으나 W4 (pH 5.5, 150°C)는 생전분보다 페이스팅 점도가 높았다(Fig. 1A). W1 (pH 3.5, 120°C)과 W3 (pH 5.5, 120°C)은 생전분보다 최고점도(peak viscosity)는 낮았고, 최저점도(trough viscosity)는 유사하였으며, 최종점도(final viscosity)는 높았다. W1은 W3에 비해 낮은 페이스팅 온도 와 낮은 최고점도를 나타내었으나 최저점도 이후에는 유사 한 페이스팅 점도 수준을 나타내었다(Fig. 1A). 반면에 일 반옥수수전분으로부터 제조된 starch citrate들은 일반적으로 생전분보다 낮은 페이스팅 점도수준을 나타내었다(Fig. 1B). N2 (pH 3.5, 150°C)는 W2와 유사하게 페이스팅 점도 가 발달하지 않았으며, N3 (pH 5.5, 120°C)는 생전분보다 페이스팅 점도가 신속히 발달되었다(Fig. 1B). 마이크로웨 이브오븐을 반응기로 제조한 starch citrate들(Jyothi et al., 2007)을 제외하고 컨벡션오븐을 반응기로 제조한 starch citrate들은 적은 함량의 저항전분을 함유하고 있는 것 조차 도 생전분보다 낮은 페이스팅 점도를 나타내거나 페이스팅 점도가 발달되지 않았다(Xie & Liu, 2004; Xie et al., 2006). 이러한 결과들은 starch citrate의 제조를 위한 반응 조건들(pH, 반응온도, 반응시간)의 차이 때문인 것으로 판 단된다. 따라서 본 연구에서는 요인분산분석을 통해 제조 된 starch citrate들의 페이스팅 점도 특성에 대한 반응조건 들의 영향을 조사하여 Table 4에 나타내었다. 주요인들과 이들의 상호작용들은 starch citrate들의 페이스팅 점도 특 성치들에 대한 효과에 있어 정도의 차이는 있지만 모든 특 성치들에 대해 유의적으로 영향을 미쳤다(p<0.01). 주요인 들에 있어 전분종류(아밀로오스 함량으로 볼 때)의 증가는 모든 페이스팅 점도 특성치들을 감소시켰으며, pH의 증가 는 반대되는 경향을 나타내었고, 반응온도의 증가는 붕괴 점도(breakdown viscosity)를 제외한 페이스팅 점도 특성치 들을 감소시켰다(p<0.01; Table 4). 페이스팅 온도는 반응 온도에, 최고점도, 최저점도와 붕괴점도는 전분종류에, 최 종점도와 노화점도(setback viscosity)는 pH에 가장 큰 영 향을 받는 것으로 분석되었다(Table 4). 한편 주요인들의 상호작용들은 모든 페이스팅 점도 특성치들에 대해 그 효 과는 차이가 있으나 동일한 경향을 나타내었다. 전분종류- pH와 전분종류-반응온도의 상호작용들은 모든 페이스팅 점 도 특성치들을 감소시키는 효과를 나타내었으며, pH-반응 온도의 상호작용은 모든 페이스팅 특성치들을 증가시키는 효과를 나타내었다. 페이스팅 온도, 최종점도와 노화점도 (setback viscosity)는 전분종류-반응온도 상호작용에, 최고 점도와 붕괴점도는 전분종류-pH 상호작용에, 최저점도는 pH-반응온도 상호작용에 의해 가장 큰 영향을 받았다. 이 상의 결과로부터 starch citrate들의 페이스팅 점도 특성은 전분종류와 pH 및 전분종류와 반응온도 사이의 상호작용 에 의해 주로 영향 받는 것으로 생각된다.

Fig. 1. Pasting viscosity profiles of starch citrates prepared from waxy (A) and normal (B) corn starches according to reaction conditions constructed by 2³ full factorial design.

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