효소처리를 이용한 복분자 추출공정의 최적화 연구

본 실험에 사용한 복분자는 (주)우리농(Wanju-gun, Jeollabuk-do, Korea)에서 구입하였으며 분석에 사용한 시 약은 모두 Sigma사(St. Louis, MO, USA)의 특급 시약을 사용하였다.

복분자의 추출 공정은 예비실험을 통하여 에탄올과 acidic sodium metaphosphate 농도, 추출 온도 및 추출 시 간을 설정하였다. 건물 1 g을 60% 에탄올 200 mL와 함께 sonicator (VC 601, Sonics & Materials Inc., Newtown, CT., USA)를 이용하여 40℃에서 1시간 추출하였으며 pH 조절제로써 0.7%(w/v) acidic sodium metaphosphate를 사 용하였다. 추출 후 수율 및 생리활성 향상을 위하여 pectinase(Pectinex Ultra SP-L, Novozyme, Bagsvaerd, Denmark)로 효소 처리를 하였고 그 다음 4000 rpm으로 15 분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상등액의 지방 성분 을 제거하기 위해 ethyl ether : n-hexane (1:6, v/v)용액으 로 세척한 다음 진공회전농축기(BÜCHI rotavapor R-124 and BÜCHI water bath B-480, Flawil, Switzerland)로 40℃에서 20 Brix까지 농축한 후 동결건조하여 시료로 사 용하였다.

복분자를 이용한 효소처리 공정의 처리조건에 대한 실험 설계는 중심합성계획(central composite design)을 사용하였 으며 흥미구역은 Pectinex Ultra SP-L(5,000 FDU/mL)의 manual에서 최적 activity 범위구간으로 정하였다. 요인은 세 가지로서 시료에 대한 효소농도(X₁) 0.5-1.5(mL/100 L), 반응온도(X₂) 20-60℃, 반응시간(X₃) 2-8시간을 흥미구역으 로 정하였으며 각 요인에 대한 수준은 Table 1과 같다. 각 독립변수는 수준을 3가지로하여 -1 − 1범위의 각 code value를 갖도록 부호화하여 중심합성계획에 따라 15구간으 로 설정하였다. 또한 이들 요인변수에 의해 영향을 받는 종속변수(Y_n)로는 총 안토시아닌 함량(Y₁), DPPH radical 소거능(Y₂), SOD-like 활성(Y₃)을 선정하였다. 효소처리 공정의 최적화를 위해 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 사용하였으며 각 인자의 수준 변화 에 따른 효소처리 공정의 최적화를 위하여 분산분석, 이차 다항회귀곡선식 및 반응표면분석법 등의 통계 방법을 이용 하였으며 통계분석은 SAS 9.3을 이용하였다(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

총 안토시아닌 함량은 Watada 와 Abbott(1975)에 따라 분 자흡광계수 65.1을 사용하여 다음과 같이 측정하였다. 동결 건조한 복분자 분말 2 g에 1.5 N HCl-95% EtOH(15:85, v/ v) 50 mL를 가하고 sonicator에서 1시간 동안 추출한 후 원심분리하여 얻어진 상층액을 같은 용매 100 mL로 정용 한 후 실온에서 2시간 암소에 방치한 후 상등액을 20배 희석하여 535 nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료 1 g을 시험관에 넣고 4.0mL의 95%(v/v)의 ethyl alcohol을 가하여 실험용액을 제조하였다. 이 용액에 0.2mM 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 용액 1.0 mL을 넣고 상온에서 30분간 반응시킨 후 U.V. visible spectrophotometer (OPTIZEN　POP, Mecasys Co., Ltd., Daejeon, Korea)를 이 용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 이용하여 동일한 방법으로 수행하였고 각 시료에 대한 자유레디칼인 DPPH radical 소거능(%)은 아 래의 식을 이용하여 계산하였다.

A : Absorbance of sample, B : Absorbance of blank

일정농도의 시료 0.2mL, Tris-HCl buffer(50mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane + 10mM EDTA, pH 8.5로 보 정) 3mL, 7.2 mM pyrogallol 0.2 mL을 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시키고 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응을 정지 시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 420 nm에서 흡광도를 측정하였으면 SOD-like 활성은 시료 용액의 첨가 구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 아래 식에 의하여 백분율로 나타내었다.

SOD-like 활성 (%) = (1−(시료 첨가구의 흡광도/무첨가 구 흡광도))×100

통계분석은 SAS(Statistical Analysis System, version 9.3) program을 이용하였으며 분산분석(ANOVA)한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 하여 처리군 간의 유의성 검정을 하였다.

세 가지 요인으로서 효소농도, 반응온도와 반응시간에 따른 복분자 추출물의 총 안토시아닌 함량, DPPH adical 소거능 및 SOD-like 활성을 분석한 결과 Table 2와 같다. 복분자의 주요 안토시아닌은 6가지로써 cyanidin 3-Osambubioside, cyanidin 3-O-xylosylrutinoside, cyanidin 3- O-rutinoside, pelargonidin 3-O-rutinoside, dephinidin 3-Orutinoside, dephinidin 3-O-glucuronide로 확인 되었다(Choung & Lim, 2012). 총 안토시아닌 함량의 경우 무처리 시에는 1.10 mg/100 g에 불과하였으나 본 실험의 효소처리의 흥미 영역 구간 실험 점에서 총 안토시아닌 함량의 범위는 2.93-8.77 mg/100 g로 나타났다. 효소농도 1.5 mL/100 L, 반 응온도 40℃ 및 반응시간 2 hr의 조건에서 8.77 mg/100 g로 가장 높았으며 무처리 시 총 안토시아닌 함량의 797% 수 준이었다. Pectinase는 세포벽의 펙틴질을 galacturonic acid 까지 분해시킴으로서 주스 생산 공정에 적용 시 추출수율 과 안토시아닌함량을 증가시킨다는 연구결과가 있다 (Buchert et al., 2005).

DPPH는 아스코르빈산, 토코페롤, polyhydroxy 방향족화 합물, 방향족 아민류 등에 의해 수소를 받아 불가역적으로 안정한 분자를 형성하여 환원되어짐에 따라 짙은 자색이 탈색되어지는 원리를 이용하여 다양한 천연소재로부터 항 산화물질을 탐색하기 위하여 많이 이용되고 있다(Jeong et al., 2009). DPPH radical 소거능은 무처리 시에는 11.76% 에 불과하였으나 효소농도 1.0 mL/100 L, 반응온도 60℃ 및 반응시간 8 hr의 조건에서 65.17%로 가장 높은 값을 보 였으며 무처리 시의 554% 수준이었다. Cellulase, papain, pectase 등 혼합효소를 이용하여 자주개자리(alfalfa)로부터 다당류를 추출하여 DPPH radical 소거능을 측정한 결과 무처리 시에는 나타나지 않았으나 1.6 mg/mL의 효소농도 에서는 87.9%로 측정되었다는 연구결과가 있다(Wang et al., 2013).

SOD-like 활성 반응에서 pyrogallol은 물에 존재하는 superoxide radical에 의해 자동 산화가 일어나 갈색물질을 형성하며 이를 분광광도계로 분석하고, superoxide 포착활성 이 있는 물질이 존재 시 pyrogallol의 산화속도가 낮아지는 원리를 이용하여 superoxide 포착활성을 간접적으로 측정 할 수 있다. 따라서 SOD(superoxide dismutase)는 생체 내 에서 superoxide의 소거에 관여하는 효소이며 안토시아닌 과 같이 SOD-like 활성을 갖는 물질을 섭취함으로서 노화 억제와 더불어 산화적 장해를 방어할 수 있다(Cho et al., 2007). SOD-like 활성의 경우 효소농도 0.5mL/100 L, 반응 온도 40℃ 및 반응시간 2 hr의 조건에서 38.32%로 가장 높 았으며 무처리 시(1.10%)의 3484% 수준이었다.

흥미구역 안에서 효소농도, 반응온도와 반응시간에 따른 복분자 추출물의 총 안토시아닌 함량, DPPH radical 소거 능 및 SOD-like 활성에 미치는 정도를 분산 분석한 결과 Table 3과 같다. 총 안토시아닌 함량에 영향을 미치는 요 인으로 효소농도가 가장 컸으며 반응온도, 반응시간 순으 로 나타났고 세 가지 요인 모두 5%내에서 유의성차이를 나타내었다. DPPH radical 소거능에서는 반응온도가 가장 컸으며 효소농도, 반응시간 순이었으며 반응시간은 5%내 에서 유의성 차이가 없었다. SOD-like 활성은 효소농도가 반응시간과 반응온도보다 큰 것으로 나타났으며 세 가지 요인 모두 5%내에서 유의성차이를 보였다. 처리 요인의 수준에 대하여 종속변수인 총 안토시아닌 함량, DPPH radical 소거능 및 SOD-like 활성을 예측하기 위한 이차다 항회귀곡선식의 회귀계수를 계산한 결과 Table 4와 같다. 총 안토시아닌 함량, DPPH radical 소거능 및 SOD-like 활 성에 대하여 이차다항회귀곡선식에의 일차다항회귀(linear), 이차다항회귀(quadratic) 및 교차회귀(cross product)의 기여 도를 검정한 결과(Table 5) 총 안토시아닌 함량의 기여도는 이차다항회귀, 일차다항회귀 및 교차회귀 순으로 나타났으 며 DPPH radical 소거능의 기여도는 교차회귀, 이차다항회 귀 및 일차다항회귀 순이었다. SOD-like 활성 기여도는 일 차다항회귀, 교차회귀 및 이차다항회귀 순으로 나타났으며 이차다항회귀곡선식 적합성 검정에서의 total regression은 모두 5% 이내에서 유의성 차이를 보였다.

효소농도, 반응온도 및 반응시간에 따른 복분자 추출물 의 총 안토시아닌 함량에 미치는 영향을 반응표면분석법으 로 분석한 결과 Fig. 1과 같다. 효소처리공정에서 반응시간 보다는 반응온도(Fig. 1-A, B, C)와 효소농도(Fig. 1-D, E, FF)에 영향을 크게 받는 것을 알 수 있으며 반응온도와 효 소농도는 비슷한 영향력을 보였다(Fig. 1-G, H, I). 효소처 리 흥미영역에서의 반응평균(response mean) 값은 4.9 mg/ 100 g이었다. 효소농도, 반응온도와 반응시간에 따른 복분 자의 총 안토시아닌 함량을 반응 표면 분석한 결과 일반적 으로 효소농도와 반응온도가 높을수록 총 안토시아닌 함량 이 증가하는 경향을 나타내었으며 효소농도 1.42 mL/ 100 L, 반응온도 60℃ 및 반응시간 2.00 hr 일 때가 최적 효소처리조건으로 8.8 mg/100 g으로 예측되었다.

Fig. 1. Contour plot for total anthocyanin contents (mg/100 g) of Bokbunja anthocyanin by enzyme-assisted extraction. (Conc. of Pectinex Ultra SP-L, A: 0.5 mL/100 L, B: 1.0 mL/100 L, C: 1.5 mL/100 L, Reaction temperature, D: 20°C, E: 40°C, F: 60°C; Reaction time, G: 2 hr, H: 5 hr, I: 8 hr

Download Original Figure

효소농도, 반응온도와 반응시간에 따른 복분자 추출물의 DPPH radical 소거능에 미치는 영향을 분석한 결과 Fig. 2 와 같으며 효소처리 흥미영역에서의 반응평균 값은 51.64% 이었다. 효소농도, 반응온도 및 반응시간이 증가함에 따라 서 DPPH radical 소거능은 증가하는 것으로 나타났다. 복 분자 추출물의 DPPH radical 소거능의 최적 효소처리조건 은 효소농도 1.41 mL/100 L, 반응온도 56.69℃ 및 반응시 간 7.37 hr 일 때 65.1%로 예측되었다.

Fig. 2. Contour plot for DPPH radical scavenging activity (%) of Bokbunja anthocyanin by enzyme-assisted extraction. (Conc. of Pectinex Ultra SP-L, A: 0.5 mL/100 L, B: 1.0 mL/100 L, C: 1.5 mL/100 L, Reaction temperature, D: 20°C, E: 40°C, F: 60°C, Reaction time, G: 2 hr, H: 5 hr, I: 8 hr)

Download Original Figure

효소농도, 반응온도와 반응시간에 따른 복분자 추출물의 SOD-like 활성에 미치는 영향을 분석한 결과 Fig. 3과 같으 며 흥미영역에서의 반응평균 값은 11.58%이었다. 효소농도, 반응온도 및 반응시간이 낮을수록 SOD-like 활성은 증가하 는 것으로 나타났으며 최적 효소처리조건으로 효소농도 0.50mL/100 L, 반응온도 20.67℃ 및 반응시간 2 hr 일 때 복 분자 추출물의 SOD-like 활성은 30.59%로 예측되었다.

Fig. 3. Contour plot for SOD-like activity (%) of Bokbunja anthocyanin by enzyme-assisted extraction. (Conc. of Pectinex Ultra SP-L, A: 0.5 mL/100 L, B: 1.0 mL/10 L, C: 1.5 mL/100 L, Reaction temperature, D: 20°C, E: 40°C, F: 60°C, Reaction time, G: 2 hr, H: 5 hr, I: 8 hr)

Download Original Figure

효소농도, 반응온도와 반응시간에 따른 복분자 추출물의 총 안토시아닌 함량, DPPH adical 소거능 및 SOD-like 활 성을 다중반응표면의 최적화방법으로써 만족 함수 (desirability function)를 이용하여 종속변수들의 가중치를 1 로 놓고 종합적으로 판단한 결과(Fig. 4) 최적 효소처리 조 건은 효소농도 0.50 mL/100 L, 반응온도 20℃ 및 반응시간 2 hr의 조건이었으며 이때의 총 안토시아닌 함량, DPPH adical 소거능 및 SOD-like 활성은 각각 5.2 mg/100 g, 61.3% 및 30.5%이었고 전반적인 만족도(overall desirability) 는 0.63이었다.

Fig. 4. Response optimization for multi-response surface of Bokbunja anthocyanin by enzyme-assisted extraction.

Download Original Figure