반응표면분석법을 이용한 복분자 콤부차의 조성 최적화

본 실험에서 사용한 홍차 잎과 복분자 당침액은 영농 조합법인 토굴발효(Gochang, Korea)에서 제공하였으며, 홍차 잎은 전라남도 보성에서 수확하여 가공된 홍차를 구매해서 덖은 후 말린 것을 받아 사용하였다. 복분자 당 침액은 전라북도 고창에서 수확한 것을 구매한 후 설탕 과 동일한 비율로 섞어서 병에 담아 3개월간 발효시킨 후 냉동 보관하였다. 홍차 발효 추출액을 위해 사용된 발효 주정은 주식회사 주정판매월드(Jeonju, Korea)에서 구입하였다. 초산 발효에 사용된 초산균(Acetobacter pasteurianus SRCM101388)은 재단법인 발효미생물산업 진흥원(Sunchang, Korea)에서 분양받아 사용하였고 젖산 발효에 사용된 유산균(Danisco^® VEGE 011 LYO; L. acidophilus, L. casei, L. paracasei, L. plantarum, DuPont de Nemours, Inc., Wilmington, DE, USA)은 구매하여 사 용하였다.

초산균을 배양하기 위해 사용한 고체 배지(GYCE Agar) 의 조성은 dextrose (Daejung Co., Ltd., Siiheung, Korea) 3% (w/v), yeast extract (Becton, Dickinson & Co., Franklin, NJ, USA) 0.5% (w/v), CaCO₃ (Duksan Pure Chemicals Co., Ltd., Ansan, Korea) 0.1% (w/v), Agar (Becton, Dickinson & Co.) 1.5% (w/v), ethanol (EtOH) 4% (w/v)이며 EtOH을 제외한 나머지를 제조하고 고압멸균기로 멸균한 다음 EtOH을 사용 직전에 첨가하였다. 배양온도는 30°C이다. 유 산균을 배양하기 위한 고체 배지(MRS Agar)의 조성은 Lactobacilli MRS Agar (Becton, Dickinson & Co.) 7% (w/v), nystatin (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 0.01% (w/v)이고 배양온도는 30°C이다.

배합비에 따라 홍차 잎을 95% (w/v) 발효 주정에 넣는 다. 홍차 잎이 다 잠길 수 있도록 물을 주정 전체의 1/4정 도 넣고 3일간 숙성한다. 숙성한 95% (w/v) 홍차 주정에 물을 첨가하여 10% (w/v) 홍차 주정을 만든다. 배합비에 따라 복분자 당침액을 10% (w/v) 홍차 주정에 넣어서 최 종 부피가 500 mL가 되도록 배합한다. 초산균과 유산균은 각각 5.6×10¹⁰ CFU/mL, 6.7×10¹⁰ CFU/mL 접종한다. 산막 형성을 방지하기 위해 60 rpm으로 설정하고 30°C에서 2주 간 발효한다.

복분자 콤부차 배합비의 최적화 조건을 찾기 위해 Design Expert 13 (Design Expert 13, Stat-Easy Co., Minneapolis, MN, USA)의 Mixture design을 이용하였다. 실험군은 예 비실험을 바탕으로 중심합성계획법(Central Composite Design)을 사용하여 설정하였다. 콤부차의 독립변수로 홍차 10-20% (w/v)와 복분자 5-10% (w/v)를 설정하여 총 9개의 실험을 설계하였다. 복분자 콤부차의 종속변수로 산도, 유 기산, ABTS 라디칼 소거활성을 설정하였다.

pH는 pH meter (DocuClip pH Meter, Sartorius Co., Gottingen, Germany)를 이용하여 측정하였으며 총 산도는 10배로 희석한 시료 10 mL에 페놀프탈레인 용액을 첨가하 여 0.1 N NaOH 용액으로 적정하였다. 또한 생균수는 복 분자 콤부차를 0.1 mL 무균적으로 취하여 증류수로 연속 희석법(serial dilution)에 따라 희석한 후 GYCE Agar와 MRS Agar에 접종하여 30°C에서 72시간 베양한 후 생균 수를 측정하였다.

유기산은 원심분리시킨 시료를 YMC-Triart C18 column (S-5m, 12 nm, 250×4.6 mm, YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan) 이 장착된 High-performance liquid chromatography (HPLC, LC-20A series, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)에 주입하여 40°C에서 100% 이동상 용매 A (0.1% phosphoric acid)를 등용매 용리(isocratic elution)로 분석하였다. 용매의 유속은 1 mL/min로 20분간 이동시키고 PDA 검출기(Photodiode Array Detector, SPD-M30A, Shimadzu Co.)로 210 nm에서 분석하였다.

총 폴리페놀은 시료 0.1 mL에 증류수 3.9 mL와 Folin- Ciocalteu’s phenol reagent (Junsei Chemical Co., Ltd, Tokyo, Japan) 0.5 mL를 첨가하여 혼합하고 5분 후에 20% Na₂CO₃ (Daejung Co.) 0.5 mL를 첨가한다. 그 후 30분 간 암소에서 반응시키고 725 nm에서 흡광도를 측정했다. 표준물질로 catechin (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 이용하여 μg catechin equivalents (CE)/mL 로 총 폴리페놀 함량을 나타냈다.

7 mM ABTS radical 용액(Biosesang inc., Seongnam, Korea)과 2.45 mM potassium persulfate (Samchun Chemical Co., Ltd., Seoul, Korea)를 혼합 후 암실에서 16시간 반응 시켰다. ABTS 용액은 734 nm에서 흡광도가 0.7±0.02가 되도록 조정했다. 시료 30 μL에 ABTS 용액 3 mL를 혼합 하고 암실에서 6분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정했다.

EtOH에 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 용해시키고 암실에서 5-8시간 녹여 준다. DPPH 용액은 515 nm에서 흡광도가 1.074±0.003이 되도록 조정한다. 시료 100 μL에 DPPH 용액 2 mL를 혼 합하고 암실에서 20분간 반응시킨 후 흡광도를 측정했다.

홍차의 농도와 복분자의 농도에 의한 복분자 콤부차의 산도, 유기산, ABTS 라디칼 소거활성에 대한 반응표면은 Fig. 1과 같다. 홍차의 농도와 복분자의 농도에 의한 복분 자 콤부차의 산도 변화에 대한 회귀곡선의 결정계수(R²)는 0.8436 (p<0.001), 유기산의 R²은 0.7752 (p<0.001), ABTS 라디칼 소거활성의 R²은 0.9970 (p<0.001)로 산도, 유기산, ABTS 라디칼 소거활성의 통계적 적합성은 인정되었다. 산 도와 유기산은 두 독립변수가 상호작용하는 2FI (twofactor interaction) Model이 선택되었고 ABTS 라디칼 소거 활성은 독립변수가 각각 작용하는 Linear Model이 선택되 었다. 콤부차의 산도와 유기산 함량은 홍차의 농도가 낮고 복분자의 농도가 높을수록 증가하는 경향을 보였고 ABTS 라디칼 소거활성은 복분자의 농도가 낮을수록 증가하는 경 향을 보였다. 홍차 시럽을 첨가하여 제조한 그릭 요거트의 이화학적 특성에 대한 연구에서 홍차 시럽의 첨가량이 증 가할수록 산도가 감소하는 경향이 나타났다(Yang & Choi, 2021). 또한 복분자의 농도를 다르게 하여 제조한 복분자 와인의 품질 특성에 대한 연구에서 복분자의 농도가 증가 할수록 산도가 증가하는 경향이 나타나(Seo et al., 2014) 본 연구 결과와 일치하는 경향이 나타났다. 산딸기의 첨가 가 해당화주의 발효에 미치는 영향에 대한 연구에서 산딸 기-해당화 혼합 발효주의 유기산 함량이 해당화 단독 발효 주의 유기산 함량보다 높다는(Han et al., 2010) 본 연구와 유사한 경향을 나타내는 보고가 있다. 복분자 콤부차의 최 적 배합비는 독립변수인 홍차의 농도, 복분자의 농도에 영 향을 받으며 유의적인 차이가 인정된 종속변수인 산도, 유 기산, ABTS 라디칼 소거활성의 전체적인 최적 조건의 최 대 범위로 설정한다. 독립변수인 홍차의 농도와 복분자의 농도는 설정한 범위 내에서 최소로 한 것을 최적으로 설정 하였고 홍차 농도와 복분자 농도 중에서는 복분자 농도가 최소인 것을 최적으로 하였다. 이것을 통해 얻은 복분자 콤부차의 최적 배합비는 홍차 농도 10% (w/v), 복분자 농 도 8.01% (w/v)로 나타났으며 이 배합비의 종속변수 예측 값은 산도 4.26%, 유기산 3,679.64 mg/100 mL, ABTS 라 디칼 소거활성 93.68%로 나타났다.

Fig. 1. Response surface of the Bokbunja Kombucha after fermentation. (A) Response surface to acidity of the Bokbunja Kombucha as a function of black tea concentration and Bokbunja concentration. (B) Response surface to ABTS radical scavenging activity of the Bokbunja Kombucha as a function of black tea concentration and Bokbunja concentration. (C) Response surface to organic acid content of the Bokbunja Kombucha as a function of black tea concentration and Bokbunja concentration.

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최적 배합비의 종속변수 예측값과 홍차 농도 10% (w/v), 복분자 농도 8.01% (w/v) 복분자 콤부차의 산도, 유기산, ABTS 라디칼 소거활성 실험값의 차이는 Table 1과 같으 며 예측값과 실험값의 평균차(Mean difference, MD)를 계 산하면 산도의 평균차는 0.065, 유기산의 평균차는 0.041, ABTS 라디칼 소거활성의 평균차는 0.061이다. 그러므로 최적 배합의 예측값과 홍차 농도 10% (w/v), 복분자 농도 8.01% (w/v) 복분자 콤부차의 실험값은 유사하다.

Table 1. Post analysis confirmation table of the Bokbunja Kombucha with 10% (w/v) concentration of black tea and 8.09% (w/v) concentration of Bokbunja.

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최적 배합비로 제조한 복분자 콤부차의 발효 과정에서 pH와 산도의 변화는 Fig. 2와 같고 초산균과 유산균의 생 균수 변화는 Fig. 3와 같다. 초산 발효가 진행되면서 0.06%이었던 산도가 발효 3일차부터 급격하게 증가하여 4.00%가 되었고 pH의 경우 초반에 4.15로 나타났으며 그 후 급격하게 감소하여 7일째에 2.77로 나타났고 이후에는 거의 변하지 않았다. 이 결과를 통해서 복분자 콤부차는 산도가 증가하면서 pH가 다소 감소한다는 것을 알 수 있 었다. 일반적으로 초산균의 초산 발효가 진행되면서 생성 되는 유기산 acetic acid로 인해 산도가 높아지고 pH가 약 간 감소되는 현상이 발생하며 본 연구도 오디를 이용하여 식초를 만든 연구처럼(Bang et al., 2020) 발효가 진행되면 서 생성된 유기산으로 인해 산도가 올라가고 pH가 감소한 것으로 나타났다(Bang et al., 2020). 초산균과 유산균의 생균수는 감소하는 형태로 나타났다. 이러한 현상은 보리 와 밀 혼합 막걸리의 품질 특성에 대한 연구에서 관찰되 었으며 발효가 진행되면서 미생물에 의한 영양소의 고갈, pH, 산도 등의 발효 환경의 변화로 인해 나타나는 것으로 판단된다(Shin et al., 2017).

Fig. 2. Changes in pH and acidity of Bokbunja Kombucha during fermentation for 14 days at 30°C.

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Fig. 3. Microbial growth of acetobacter and lactobacillus during the Bokbunja Kombucha fermentation for 14 days at 30°C.

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복분자 콤부차 내 유기산의 발효 전과 발효 후 변화는 Table 2와 같다. 발효 전 복분자 콤부차 내 유기산의 함량 은 lactic acid, acetic acid, oxalic acid 순으로 많았지만, 발효 후에는 초산균의 초산발효로 인해 acetic acid가 3,705.34 mg/100 mL로 가장 높았고 lactic acid는 117.95 mg/100 mL의 함량을 나타냈다. 홍차와 녹차로 만든 콤부 차에 함유되어 있는 유기산 중에서 acetic acid의 함량이 가장 높으며(Jayabalan et al., 2007), 복분자 콤부차 또한 유기산 중에서 acetic acid의 함량이 가장 높다는 것을 확 인할 수 있었다.

Table 2. Changes in organic acid contents in Bokbunja Kombucha

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폴리페놀은 식물계에 널리 분포되어 있으며 과일과 엽 채류에 다량 함유되어 있다. 폴리페놀에 존재하는 다수의 -OH는 여러 화합물과 쉽게 결합하는 특성을 가지고 있으 며 항산화, 항암, 항염 효과가 뛰어나다는 보고가 있다(Dai & Mumper, 2010). 복분자 콤부차의 발효 전과 후 총 폴 리페놀 함량의 변화는 Fig. 4와 같다. 발효 전 복분자 콤부 차 내 총 폴리페놀 함량은 480.83 μg CE/mL이며 발효 후 에는 763.33 μg CE/mL로 증가하였다.

Fig. 4. Changes in total polyphenol contents of the Bokbunja Kombucha before and after fermentation. Error bars are SD of the Mean. The stars indicate a highly significant difference as revealed by a Tukey test (p<0.001).

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복분자 콤부차의 발효에 따른 항산화 활성의 변화는 ABTS, DPPH 라디칼 소거활성 측정법을 통해 측정한 결 과 각각 Fig. 5, Fig. 6와 같다. 복분자 콤부차의 ABTS 라 디칼 소거활성은 발효 전 96.12%에서 발효 후 89.81%로 활성이 감소했으며 DPPH 라디칼 소거활성 또한 발효 전 74.05%에서 발효 후 46.09%로 활성이 감소하여 ABTS와 유사한 경향이 나타났다. 본 연구에서 복분자 콤부차는 총 폴리페놀 함량이 증가하였으나 항산화 활성이 감소하는 현 상이 나타났다. 이러한 현상은 콤부차의 장기간 발효시 SCOBY의 물리화학적 특성과 항산화 활성에 대한 연구 (Amarasinghe et al., 2018)와 차와 쌀, 보리로 제조한 콤부 차의 생화학적 변화와 항산화 활성에 대한 연구에서 관찰 되었다(Ahmed et al., 2020).

Fig. 5. Changes in the ABTS radical scavenging activity of the Bokbunja Kombucha before and after fermentation. Error bars are SD of the Mean. The stars indicate a highly significant difference as revealed by a Tukey test (p<0.001).

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Fig. 6. Changes in the DPPH radical scavenging activity of the Bokbunja Kombucha before and after fermentation. Error bars are SD of the Mean. The stars indicate a highly significant difference as revealed by a Tukey test (p<0.001).

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