변온 저장 중 초고압 처리와 Micro-perforated Film 포장 병용이 김칫속의 품질에 미치는 영향

본 연구에서는 광주광역시 소재의 김치가공업체에서 당 일 제조한 김칫속을 구입하여 시료로 사용하였다. 김칫속 원료 및 구성 비율은 고춧가루(26.6%), 찹쌀풀(19.5%), 멸 치액젓(16.0%), 새우젓(8.0%), 다진 마늘(7.1%), 대파(7.1%), 무즙(5.3%), 사과즙(3.5%), 소금(3.5%), 다시마 육수(1.6%), 다진 생강(0.9%)과 설탕(0.9%)이다.

초고압 처리는 pilot-scale high hydrostatic pressure (HHP) system (R–SCS SW, ChemRe SYStem Inc., Anyang, Korea)을 이용하였다. HHP system은 6 L 용량의 vessel과 water jacket 형태의 냉각기가 설치되어 있으며 최대 작동 압력은 600 MPa이다. Vessel 내부의 압력 전달 유체는 2-ethylhexyl sebacate oil (Maxifluid, Maximator GmbH, Nordhausen, Germany)이 사용되었으며 가압 속도는 약 100±3MPa/min이었다. 김칫속 시료는 laminated film vacuum bag (nylon/polyethylene, CSE Co., Siheung, Korea)을 이용하여 진공 포장 후 600MPa의 압력으로 5분 동안 처리하였으며 해압(depressurization)은 2분 이내에 이 루어졌다.

초고압 처리 후 김칫속 시료는 clean bench에서 multilayer (ML) film bag (polyethylene terephthalate/aluminum/ polyethylene, 130×200 mm, 0.1 mL O₂/m²·day·atm, Pack4U Co., Seoul, Korea)과 MP-film bag (130×200 mm, 5,000 mL O₂/m²·day·atm, GQGONE Co., Gimhae, Korea)에 150 g씩 각각 옮겨 담은 후 밀봉하였다. 특히 MP-film bag은 기체 투과도를 높이기 위하여 내측의 pegmatite 분말 혼합 lowdensity polyethylene film과 외측의 미세천공 적층 film (polyethylene terephthalate/aluminum/low-density polyethylene, Φ: 0.005-0.2 mm×49 holes/100 cm²)을 부분 합지하여 제작 하였다. 장기 저장 중 저장 온도 변화가 김칫속의 미생물 학적 및 이화학적 품질 특성에 미치는 영향 분석을 위한 모의 변온 저장 시험 조건으로 포장된 김칫속 시료는 냉장 기준 최저온도인 0±1°C에서 60일간 저장하였으며 이후 8 일간 20±1°C 상온에 저장하였다.

변온 저장 중 김칫속의 미생물 수 측정을 위해 시료 20 g과 0.85% 멸균 생리식염수 180 mL는 멸균 stomacher bag에 넣은 후 stomacher (Bagmixer R400, Interscience Inc., Saint Nom, France)를 이용해 3분간 균질화하였다. 균질 용액을 0.85% 멸균 생리식염수로 10배수 연속 희석한 후 희석액 1 mL는 각각의 배지에 분주하였다. 총 호기성 세균 은 plate count agar (PCA, BD/Difco., Detroit, MI, USA) 를 사용하여 37°C에서 48시간 배양 후 형성된 집락을 계 수하였다. 총 유산균은 de Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS, BD/Difco., Detroit, MI, USA)를 사용하여 37°C에 서 48시간 혐기배양 후 형성된 황색 집락을 계수하였다. 대장균군은 Petrifilm CC (Petrifilm CC, 3M Co., St. Paul, MN, USA)를 사용하여 37°C에서 24시간 배양한 후 기포 가 생성된 붉은 집락을 계수하였다. 검출된 미생물 수는 colony forming unit per gram (CFU/g)으로 나타내었다.

저장 0, 60과 68일 후 대조구와 초고압 처리구 김칫속 시료로부터 총 호기성 세균 계수에 사용된 PCA plate에 성장한 단일 colony를 처리구별 5종씩 확보하였다. 분리된 균주의 16S rRNA 유전자는 universal primer인 27F (5’- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)과 1492R (5’- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)를 사용하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 90°C에서 5분간 변성 후, 95°C에서 30초, 55°C에서 120초, 68°C에서 90초를 30번 반복 반응한 후 마지막으로 68°C에서 10분간 반응시켰다. 유전자 증폭 산물은 1.5% agarose gel에서 20분간 전기영 동하여 band를 확인한 후 Montage PCR Cleanup Kit (Millipore Co., Bedford, MA, USA)를 이용하여 정제하였 다. 정제된 16S rRNA의 염기서열 분석은 (주)마크로젠 (Macrogen, Daejeon, Korea)에 의뢰하였으며 분석된 염기 서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) BLAST 자료와 비교하여 99% 이상의 유사도를 보일 때 특정한 과, 속 및 종으로 동정하였다.

김칫속의 pH와 전기전도도는 multiparameter benchtop meter (Orion VERSA STAR 90, Thermo Fisher Scientific Inc., Chelmsford, MA, USA)에 장착한 pH 전극(Orion 8157BNUMD ROSS Ultra pH/ATC Triode, Thermo Fisher Scientific Inc., Chelmsford, MA, USA)과 전기전도도 전극 (Orion 013005MD Conductivity Cell, Thermo Fisher Scientific Inc., Chelmsford, MA, USA)을 이용하여 실온에 서 측정하였다.

환원당 함량은 dinitrosalicylic acid (DNS) 방법에 따라 측정하였다(Miller, 1959). 시료를 1차 증류수로 50배 희석 후 희석한 시료 용액 1 mL는 DNS 시약 3 mL와 혼합하여 100°C water bath에서 5분 동안 중탕시켰다. 중탕 완료 후 시료-DNS 혼합 용액은 실온에서 충분히 냉각시킨 다음 증 류수 16 mL를 가하여 희석한 후 분광광도계(UV-1800, Shimadzu Scientific Instruments Inc., Columbia, MD, USA) 를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준검량선 은 표준물질로서 glucose (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 농도별로 DNS 시약과 반응시켜 작성하였으 며 환원당 함량은 mg/g으로 나타냈다.

김칫속의 염도는 Mohr’s titration 방법에 따라 분석하였 다(AOAC, 2005). 1차 증류수로 100배 희석한 시료 용액 10 mL에 지시약 2% potassium chromate 용액 1 mL을 가 한 후 혼합 용액이 적갈색이 될 때까지 0.02 N AgNO₃ 용 액으로 적정하였다. 염도(%)는 0.02 N AgNO₃의 소비량을 통해 계산하였다.

김칫속의 CIE redness (a*) 값은 시료 20 g을 원형 cell 에 옮겨 담은 후 표준백반(X=0.3163, Y=88.5, Z=0.3233) 으로 보정된 색차계(CR-400, Konica Minolta Inc., Tokyo, Japan)를 이용하여 각 시료의 표면을 무작위로 5회 이상 반복 측정하였다.

변온 저장 중 김칫속 ML-film bag과 MP-film bag 내부 headspace의 O₂와 CO₂ 농도(%) 변화는 포장재 표면에 septum을 부착한 후 headspace gas analyzer (Checkpoint 3 premium, Dansensor, Ringsted, Denmark)를 이용하여 측정 하였다.

모든 실험 결과는 3회 이상 반복 분석하여 평균값±표준 편차로 나타냈다. 결과에 대한 유의성 통계분석은 SPSS (Statistical Package for the Social Science, Version 19, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software program을 사용하 여 one-way analysis of variance test (ANOVA)를 실시하 였고 유의성 검정은 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test로 행하였다.

초고압 처리 후 ML-film bag과 MP-film bag에 각각 포 장한 김칫속의 변온 저장 중 미생물 수 변화는 Fig. 1에 나타내었다. 저장 초기 김칫속의 총 호기성 세균 수는 5.92 log CFU/g이었으며 0°C에서 60일간 저장 후 ML-대 조구와 MP-대조구의 총 호기성 세균 수는 5.89와 5.84 log CFU/g으로 저장 초기와 유의적인(p>0.05) 차이를 보이 지 않았다. 저온 저장 60일 이후 20°C에서 8일간 상온 저 장은 ML-대조구와 MP-대조구의 총 호기성 세균 수를 6.63과 6.85 log CFU/g까지 증가시켰다. 반면 저장 68일 후 ML-초고압 처리구와 MP-초고압 처리구의 총 호기성 세균 수는 각각 5.44와 5.33 log CFU/g으로 ML-대조구 또는 MP-대조구와 비교하여 유의적으로(p<0.05) 낮은 수 준을 유지하였다. 저장 초기 김칫속의 총 유산균 수는 5.25 log CFU/g이었다. 600 MPa 초고압 처리는 총 유산 균 수를 검출한계(1 log CFU/g) 미만까지 감소시켰으며 저장 68일까지 포장 형태와 관계없이 초고압 처리구에서 총 유산균은 검출되지 않았다. 한편 저장 60일 이후 20°C 에서 8일간 상온 저장은 ML-대조구와 MP-대조구의 총 유 산균 수를 7.91과 7.98 log CFU/g까지 각각 증가시켰다. 600 MPa 초고압 처리 직후 김칫속의 대장균군 수는 검출 한계(1 log CFU/g) 미만까지 감소하였으며 변온 저장 68 일 동안 ML-초고압과 MP-초고압 처리구의 대장균군은 불 검출되었다(data not shown).

Fig. 1. Change, during storage for 68 days, in the counts (log CFU/g) of total aerobic bacteria (a) and total lactic acid bacteria (b) in kimchi sauces treated with high hydrostatic pressure at 600 MPa. Means with different uppercase letters (A and B) differ significantly (p<0.05) for the same storage day among treatments. Means with different lowercase letters (a and b) differ significantly (p<0.05) for the same treatments within different storage days.

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한편 본 연구에서 600 MPa 초고압 5분 처리에 따른 김 칫속 총 호기성 세균 수의 0.5 log cycle 미만 감소한 결 과는 550 MPa 초고압 5분 처리로 숙성된 절임무의 총 호 기성 세균 수를 5.57 log cycle 감소시켰다는 Bao et al. (2016)의 보고와 차이를 보였다. Buerman et al. (2020)은 450과 600 MPa 초고압 처리에 따른 사과 주스에 접종한 효모와 곰팡이 수의 감소 효과는 Aw 0.94-0.96과 pH 7.0 시료에 비해 Aw 0.98 이상과 pH 4.6인 시료에서 높게 나 타났다고 보고하였다. 선행 연구와 본 연구 결과를 종합하 면 초고압에 의한 미생물 불활성 효과는 식품의 물리적 형 태와 화학적 특성, 초기 미생물 오염 수준 및 초고압 환경 노출에 대한 미생물 종류별 감수성에 따라 차이가 있다. 또한 Peñas et al. (2010)은 300 MPa 초고압 처리가 0.5와 1.5% NaCl 용액을 이용하여 자연 발효된 sauerkraut의 호 기성 세균과 유산균 수를 6.07-6.24 log CFU/g에서 1.66- 2.03 log CFU/g으로 감소시켰으며 4°C에서 3개월간 저장 중 초고압 처리한 sauerkraut의 호기성 세균과 유산균 증식 은 대조구와 비교하여 억제되었다고 보고하였다. 본 연구 결과 초고압 처리와 0°C 저온 저장의 병합은 김칫속에 존 재하는 유산균과 대장균군의 불활성화 및 저장 중 증식 억 제에 효과적인 방법이라고 판단된다.

저장 기간에 따른 김칫속 우점 호기성 세균 변화를 살펴 보기 위해 저장 초기 및 저장 60과 68일 후 대조구와 초 고압 처리구 시료로부터 분리한 균주들을 동정한 결과는 Table 1에 나타냈다. 저장 초기 ML-대조구와 MP-대조구 로부터 분리한 총 10개 균주는 Bacillus 속으로 동정되었 으며 ML-초고압과 MP-초고압 처리구로부터 분리한 총 10개 균주도 Bacillus 속으로 동정되었다. 저장 68일 후 ML-대조구과 MP-대조구로부터 분리한 총 10개 균주는 Pediococcus pentosaceous로 동정되었다. 이는 변온 저장 기간 동안 발효에 의해 대조구 김칫속 시료의 호기성 세 균 분포 변화가 있었음을 의미한다. 김치 발효에 있어 Pediococcus 속은 Lactobacillus 속 생육 전에 우세하게 존 재하는 유산균으로서 pediocin을 생성하여 Bacillus 속과 Staphylococcus 속 등 부패 미생물의 생장을 억제한다(Jang et al., 2014).

반면 저장 68일 후 ML-초고압 처리구로부터 분리한 5 개 균주는 Staphylococcus 속, Bacillus 속과 Micrococcus 속으로 각각 동정되었으며 MP-초고압 처리구로부터 분리 한 5개 균주는 모두 Bacillus 속으로 나타나 ML-초고압 처리구와 다소 차이를 보였다. 이러한 결과를 통해 저장 전 600 MPa 초고압 처리에 의한 김칫속의 유산균 불활성 화가 변온 저장 68일 동안 김칫속 발효 억제에 영향을 미 친 것으로 보인다. Bacillus licheniformis, Staphylococcusepidermidis와 Micrococcus luteus는 물 또는 토양 유래 미 생물로 알려져 있으며 별도의 살균 공정이 없이 제조하는 김칫속의 원부재료인 고춧가루, 무, 양파, 파 또는 생강 등 으로부터 유입한 것으로 판단된다.

본 연구에서 수행한 초고압 처리에 따른 저장 중 김칫속 호기성 세균의 16S rRNA sequence 분석 결과를 토대로, 대사체 분석 기술을 이용하여 저장 온도에 따른 김칫속 미 생물 군집 차이 구명 연구와 초고압 처리의 Bacillus 속 제어 효과 향상을 위한 다른 물리적 또는 화학적 살균 기 술 병합 연구가 추가적으로 필요하다.

초고압 처리 후 ML-film 또는 MP-film bag에 포장한 김칫속의 변온 저장 중 pH, 환원당, 전기전도도, 염도와 적색도 변화는 Table 2에 나타내었다. 0°C 저온 저장 60일 동안 ML-대조구와 MP-대조구의 pH는 5.80에서 5.53과 5.61로 각각 감소하였다. 또한 저온 저장 종료 후 8일간 20°C 상온 저장은 ML-대조구와 MP-대조구의 pH를 4.38 과 4.07까지 각각 감소시켰다. 반면 저장 68일 후 ML-초 고압 처리구와 MP-초고압 처리구의 pH는 5.53과 5.56으로 각각 나타나 저장 초기와 유사하였다. 저장 중 김치류의 pH 감소는 유산균 발효로 인한 유기산 생성과 관련이 있 다(Meng et al., 2015;Park, 2018). 본 연구에서 저장 전 600 MPa 초고압 처리가 김칫속에 존재하는 유산균을 불활 성화시켰기 때문에 변온 저장 중 김칫속의 pH 변화가 작 은 것으로 판단된다.

ML-대조구와 MP-대조구의 환원당 함량은 저장 기간이 경과함에 따라 유의적으로(p<0.05) 감소하여 변온 저장 68 일 후 23.09와 22.65 mg/g으로 나타났다(Table 2). 반면 저 장 68일 동안 ML-초고압 처리구와 MP-초고압 처리구의 환원당 함량은 44.02-46.11과 43.25-46.39 mg/g 수준을 각 각 유지하였으며 포장재 종류에 따른 유의적 차이는 보이 지 않았다(p>0.05). Zheng et al. (2014)은 열처리 또는 초 고압 처리한 litchi juice에 Lactobacillus casei 접종 후 발 효한 결과 두 주스 시료의 총 당 함량이 발효 전에 비해 감소하였지만 초고압 처리한 juice가 열처리한 주스에 비해 높은 당 함량을 보였다고 보고하였다. Ye et al. (2019)은 유산균 접종 발효 후 broccoli puree의 유리당 함량이 233 mg/g에서 5-115 mg/g으로 감소하였는데 이러한 결과는 발 효 중 puree에 존재하는 glucose, fructose와 sucrose가 유 산균 에너지 대사에 이용되기 때문이라고 보고하였다. 이 러한 연구 결과를 토대로 장기 저장 중 김칫속의 품질 안 정성을 판단할 때 김칫속 내 잔존 환원당 함량은 품질 지 표로 활용할 수 있다.

68일 변온 저장 중 ML-초고압 처리구와 MP-초고압 처 리구의 전기전도도와 염도는 43.76-46.11 mS/cm과 4.61- 4.75%를 각각 유지하였으며 ML-대조구 또는 MP-대조구와 비교하여 유의적 차이(p>0.05)를 나타내지 않았다. Song et al. (2016)은 4°C에서 8주 저장 기간 동안 김칫속의 염 도가 3.70-3.93%로 일정하게 유지하였다고 보고하였다. 또 한 Cheon et al. (2016)의 연구에서 4°C 저장 21일 동안 2-10 kGy 전자선 조사한 김칫속의 염도가 저장 초기 수준 을 유지하였다는 결과는 본 연구와 유사하였다.

김칫속의 적색도는 소비자가 김치의 외관적 품질을 결정 하는 중요한 요소이다(Cheon et al., 2016). 변온 저장 동 안 ML-대조구, MP-대조구, ML-초고압 처리구와 MP-초고 압 처리구의 CIE a* 값은 13.91-15.86으로 나타나 초고압 처리, 포장재 종류와 저장 온도는 김칫속의 색 품질에 영 향을 미치지 않았다. 초고압 비열처리는 식품의 색, 향과 영양 성분에 관여하는 공유 결합이나 수소 결합에 영향을 주지 않는다(de Oliveira et al., 2015). 100-400 MPa 초고 압 15-30분 처리가 mango pulp의 CIE a* 값에 영향을 미 치지 않았다는 Ahmed et al. (2005)의 보고는 본 연구 결 과와 유사하였다. 또한 Wang et al. (2015)은 500 MPa 초 고압 처리 시 Chinese bayberry juice의 적색도 값이 일정 하게 유지하였음을 보고하였다.

저장 중 발효식품의 포장 내부 headspace 가스 농도는 발효 미생물 생장 속도, 저장 온도와 포장재의 통기성에 의해 결정된다(Lee & Yoo, 2017). 변온 저장 중 초고압 처 리와 포장 film 종류에 따른 김칫속 포장 내부 headspace O₂와 CO₂ 농도 변화는 Table 3에 나타내었다.

0°C 저온 저장 60일 후 ML-대조구의 O₂ 농도는 18.2% 로 저장 초기 대비 약 2.6% 감소하였으며 특히 61-68일간 20°C 상온 저장은 ML-대조구의 O₂ 농도를 11.4%까지 급 격히 감소시켰다. 또한 68일 후 ML-대조구의 CO₂ 농도는 27.9%까지 증가하였다. 반면 변온 저장 68일 후 ML-초고 압 처리구의 O₂와 CO₂ 농도는 각각 19.6과 2.1%로 ML-대 조구와 비교하여 뚜렷한 차이를 보였다. 변온 저장 68일 동안 MP-초고압 처리구와 MP-대조구의 O₂와 CO₂ 농도는 19.8-20.8%와 0.0-2.4% 수준을 각각 유지하였다. 김치류 저 장 중 유산균 발효에 의해 젖산, 초산, 알코올과 CO₂가 생 성되며 포장 내부에 축적된 CO₂는 포장의 팽창과 과숙 등 김치 상품성에 부정적인 영향을 미친다(Jeong et al., 2019). Cheon et al. (2016)은 김칫속에 전자선을 조사 후 4°C에서 21일간 저장한 결과 김칫속 pouch 포장 내부 headspace CO₂ 농도가 47.37%까지 증가하였다고 보고하였다.

따라서 600 MPa 초고압 처리, MP-film 포장과 0°C 저 온 저장의 병합 적용은 김칫속에 존재하는 유산균 생육과 포장 내부 가스 농도 변화 억제에 효과를 나타내는 것으로 판단된다.