말토덱스트린 또는 사이클로덱스트린을 이용한 미세캡슐화공정이 옥수수 수염 추출물의 수분흡습과 생리활성에 미치는 영향

시료는 메이신(maysin)함량이 가장 높은 시기인 출사 후 2-7일 사이에 채취한 미수정(unfertilized) 옥수수 수염으로 농촌진흥청(Jeonju, Korea)으로부터 조달받았다. 강원도 영 월산 일반 옥수수 수염의 경우 메이신 함량은 40.79 mg/ 100g이었으나 미수정 옥수수 수염의 경우 818.69 mg/100g 이었다. 피복물질인 maltodextrin과 cyclodextrin은 각각 ㈜ 한국마쯔다니(Seongnam, Korea)와 대상㈜전분당(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

본 실험실에서 분석한 최적 에탄올 공정으로써 시료 1 g 당 에탄올 30 mL의 조건에서 에탄올 80.45%, 추출온도 53.49°C, 추출시간 4.95 h의 공정으로 플라스크를 이용하여 shaking incubator (HZQ-311, Neuronfit, Seoul, Korea)로 추 출하였으며 에탄올 추출한 시료를 동결 건조(SFDSM24L, Samwon Freezing Engineering Co., Seongnam, Korea)하 였다. 옥수수 수염 에탄올 추출 동결건조 시료의 생리활 성 물질함량 및 기능성 향상을 위한 효소처리공정으로써 Novozyme사(Bagsvaerd, Denmark) Celluclast 1.5 L FG (700 endoglucanase unit/g) 효소를 이용하였으며 효소농도 0.75%, 반응온도 28.91°C, 반응시간 1.81 h의 조건에서 효 소처리를 한 후 동결건조 과정을 거쳐 분말로 제조한 다음 핵물질로 사용하였다. 에탄올 추출공정과 효소처리공정의 최적화는 중심합성설계법(central composite design)에 의하 여 진행되었으며 Design-Expert program을 이용한 다중반 응표면 최적화(multi-response surface optimization)에 의하 여 각각의 공정조건이 설정되었다.

앞서의 공정으로 제조된 옥수수 수염 추출물을 핵물질로 사용하였고, 피복물질로는 maltodextrin, cyclodextrin, maltodextrin과 cyclodextrin을 1:1 (w/w)로 혼합한 세 가지 피복 물질을 이용하였다. 미세캡슐 공정은 핵물질에 피복물질과 증류수를 1:4(w/w)로 첨가하여 수화시킨 후 hydro-shear homogenizer (Janke & Kunkel, IKA^® Labortechnik, Staufen, Germany)를 이용하여 8,000 rpm에서 30분간 균질화 시켜 제조하였다. 균질화 후 동결건조기(SFDSM24L, Samwon Freezing Engineering Co., Seongnam-si, Korea)로 수분 함 량 6%(dry basis)까지 건조한 다음 평균직경 28.84 μm 크 기의 분말을 제조하였다.

시료의 미세구조는 scanning electron microscope (S- 4300, HITACH Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다. SEM ion sputter coater (E1030, HITACH Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 진공상태에서 60초간 gold-palladium으 로 10-30 nm의 두께로 코팅한 다음 이를 10.0 kV에서 앞 서의 동결건조를 거친 분말시료를 관찰하였다.

Particle size analyzer (Maxtersizer 2000G, Malvem instrument, Worchester, England)를 이용하였으며 시료를 에탄올 을 용매로 사용하여 1분간 초음파처리로 분산시킨 후 시료 의 평균 입자크기를 측정하였다.

수분흡수지수(water absorption index, WAI) 및 수분용해 지수(water solubility index, WSI) 측정은 Phillips et al. (1988)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 0.5 g에 20 mL 증류수를 첨가하여 3,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 침전물로 수분흡수지수를 산출하였으며, 상등액은 미리 무 게를 구한 수기에 분리하여 105°C에서 4시간동안 건조시 킨 다음 고형분을 이용하여 수분용해지수를 아래의 식에 의하여 계산하였다.(1)(2)

항산화능을 측정하기 위하여 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH)의 환원에 의한 자유 라디칼 소거능력을 측정하였다 (Sarepoua et al., 2013). 각 시료용액을 각각 0.3 mg씩 2.0× 10^-4M DPPH methanol solution 2.5 mL에 첨가하여 최종 반응 액이 2.8 mL가 되도록 하였다. 10초간 진탕하여 상온 에서 30분 반응 시킨 후 UV-visible spectrophotometer (UV 1601, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 517 nm에서 흡 광도를 측정하였다. 얻은 결과는 대조구에 대한 소거능력 (%)으로 나타내었다.(3)

Hydroxyl radical 소거능은 Halliwell et al. (1987)의 방법 에 따라 Fenton 반응에 의한 2-deoxyriose가 hydroxyl radical 에 의해 산화되어 malonaldehyde로 변환된 후 chromagen을 형성하는 정도를 측정하는 방법을 이용하였다. 2.8 mM 2- deoxy-D-ribose와 1.4mM H₂O₂를 함유하는 10mM potassium phosphate buffer (pH 7.4)를 일정량의 증류수에 녹인 각각 의 시료와 premix 된 EDTA/FeCl₂ (100 uM EDTA pH 7.0, 20 uM FeCl₂)를 첨가하여 최종반응 액이 2.0 mL가 되게 한 다음 37°C에서 4 h 동안 반응시켰다. 10% trichloroacetic acid (TCA)로 반응을 중지시키고 1% thiobarbituronic acid (TBA)와 잘 혼합하여 95°C에서 20 분간 반응시킨 후 실온 에서 냉각하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 같은 시 료로 반응 시간 없이 동일한 과정을 반복하였고 대조구는 시료 대신 증류수를 이용하여 동일한 방법으로 수행하였다. 각 시료에 대한 hydroxyl radical 소거능(%)은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.(4)

Tyrosinase 저해활성은 dopachrome법을 이용하여 UVvisible spectrophotometer로 측정하였다(Kwon et al., 2012). 0.2M potassium phosphate buffer (pH 6.5) 2 mL 및 2 mM L-tyrosine 0.2 mL의 혼합액에 시료 0.2 mL를 첨가하였다. 여기에 mushroom tyrosinase (100 units/mL, ≥1,000 unit/ mg solid, EC 1.14.18.1, Sigma, St. Louis, MO, USA) 0.1 mL를 첨가하여 37°C에서 20분간 반응시킨 후 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료에 대한 tyrosinase 저해활성 (%)은 아래의 식을 이용하여 계산하였다.(5)

본 실험결과는 모든 반응 치에 대하여 3반복으로 수행된 평균값과 표준편차로 나타내었으며 SAS 9.3(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) program을 이용하여 분산분석 (ANOVA)한 후 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 하여 처리군 간의 유의성 검정을 하였다.

옥수수 수염 추출물을 동결 건조하여 캡슐화 하지 않은 대조구와 미세캡슐화한 처리구의 표면미세구조를 주사전자 현미경으로 900-1,800배 확대한 후 촬영한 외관은 Fig. 1 과 같다. 대조구(×900)는 달걀형의 상태로 확인 되었으며 표면은 매끄러운 상태를 보여주었다. 반면에 처리구 (×1800)의 경우 미세캡슐화 과정에서 분쇄되어 입자크기가 작아졌으며 다양한 형태로 나타났다. Maltodextrin (MD) 처리구는 형태가 일정하지 않았으며 표면미세구조는 거칠 게 나타났다. Cyclodextrin (CD) 처리구는 직육면체에 가까 운 형태를 보였으며 표면은 매끄러운 상태로 나타났다. MD와 CD를 1:1(w/w)로 혼합한(MD+CD) 경우는 형태는 대조구보다 각이 졌으며 표면은 대조구와 유사하게 매끄러 운 상태를 보여주었다. 미세캡슐화 한 처리구의 형태 및 표면미세구조가 다른 이유는 피복 물질마다 다른 용해도, 점도, 다공성 등의 물리적특성을 지니고 있기 때문이다 (Estevinho et al., 2013).

Fig. 1. Scanning electron micrographs of microencapsulated corn silk extracts. A: control (corn silk extracts, ×900), B: maltodextrin microencapsulated corn silk extracts (×1800), C: cyclodextrin microencapsulated corn silk extracts (×1800), D: maltodextrin+ cyclodextrin microencapsulated corn silk extracts (×1800).

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미세캡슐화한 옥수수 수염 추출물의 입자분포의 결과는 Table 1과 같다. 미세캡슐화 전과 후의 입자 크기 분포를 비교하여 보면 대조구의 평균 직경은 28.84 μm이었으며 MD, CD, MD+CD 처리구의 경우 각각 5.67, 3.61, 3.85 μm으로 작아졌다. 이는 미세캡슐화 과정에서 hydro-shear homogenizer의 고속회전(8,000 rpm)에 의하여 전단응력으 로 옥수수 수염 추출물의 입자가 분쇄되었기 때문이다.

미세캡슐화한 옥수수 수염 추출물 분말의 WAI 및 WSI 는 Table 2와 같다. 식품 가공 산업 측면에서 WAI와 WSI 는 분말의 안정성에 있어서 매우 중요한 요인으로 저장안 정성측면에서 낮은 WAI 값과 높은 WSI 값을 요구한다 (Chae & Hong, 2016). 대조구의 WAI 값은 0.68로 가장 높은 지수를 보였으며 처리구의 경우는 0.20-0.26으로 낮은 지수를 나타내었다. 처리구 중에선 MD+CD 처리구가 0.20 으로 가장 낮은 수분흡수지수를 나타났으며 모든 처리군 간에 유의적 차이를 나타내었다(p<0.05). 일반적으로 흡습 현상이 높으면 분말의 뭉침 현상 발생이 증가하고, 수분에 의한 품질변화로 인해 저장안정성이 낮아진다. 수분결합력 은 비 결정부분(amorphous)에 의한 것으로 비결정부분이 많거나 내부치밀도가 낮으면 수분의 결합력이 증가한다 (Peterson & Brockel, 2015). 일반적으로 분말식품은 수분함 량이 증가함에 따라서 free flowing, bridging, agglomeration, compaction, liquefaction의 단계를 거치게 된다(Aguilera et al., 1995). 옥수수 수염 분말은 매우 흡습성이 높은 소재로 서 본 실험실에서 25°C, 75% RH조건으로 12 h 저장 시 200 mesh를 통과하는 미세 옥수수 수염 분말의 경우 케 이킹(caking)정도는 90%이었으며 수분흡수는 0.48 g water absorbed/g dried corn silk이었다.

WSI에서는 대조구가 72.23%로 가장 낮은 지수를 나타 내었으며 CD 처리구가 95.23%로 가장 높은 지수를 나타 내었다. 그 다음으로 MD+CD 처리구 89.53%, MD 처리구 82.06% 순으로 나타났으며 모든 처리군 간에 유의적 차이 를 보였다(p<0.05). WSI는 분말소재의 복원품질지표(reconstitution quality index)로서 이용되고 있으며 일반적으로 소 비자는 빠르며 완벽한 복원을 요구한다(Mahdijafari et al., 2017). CD는 전분에 CD 생성효소(ED2.4.1.19, cyclodextringlycosyl- transferase, CGTase)를 작용하여 만든 것으로 6개 (α-CD), 7개(β-CD), 8개(γ-CD)의 포도당이 α-1,4-glucoside 결합으로 연결된 환상의 도넛모양을 한 비환원성 말토올리 고당이다. 도넛구조 내측에는 수소가 배열되어 있어 소수 성을 나타내고, 외측은 수산기가 배열되어 친수성을 갖는 독특한 성질을 가지고 있으며 우수한 포집성을 가지고 있 기 때문에 캡슐공정에서 피복물질로 많이 이용된다(Konno et al., 1982). 자몽 맛이 나는 nootkatone을 CD로 캡슐화 하였을 때 WSI가 6.5-9.1배 증가하는 것으로 나타났다 (Kfoury et al., 2017). WSI는 미세캡슐 방법 및 공정조건, 피복물질 종류, 입자크기 등에 따라서 달라진다(Jafari et al., 2017).

미세캡슐화 처리에 따른 옥수수 수염 추출물의 항산화활 성을 DPPH radical 소거활성 및 hydroxyl radical 소거 능으 로 분석한 결과 Table 3과 같다. 옥수수 수염의 항산화 작용 을 하는 주된 성분은 maysin [rhamnosyl-6-C-(4-ketofucosyl)- 5,7,30,40-tetrahydroxyflavone]과 flavone glycoside이다(Zilic et al., 2016). DPPH radical 소거활성은 분자 내에 안정한 radical을 함유하지만 항산화물질의 전자공여 능으로 인해 방향족화합물 및 방향족아민류에 의해 환원되어 자색이 탈 색이 되는 정도를 지표로 하여 항산화활성을 측정하는 방법 이다(Yoshino & Murakami, 1998). 옥수수 수염 추출물의 미세캡슐화 처리에 따른 DPPH radical 소거활성 측정 결과 대조구에서는 18.60%로 가장 낮았으며 처리구에서는 79.40- 89.25%로 대조구과 비교하였을 때 매우 높은 활성을 보이 는 것을 확인할 수 있었다. 특히 CD 처리구는 대조구에 비 하여 약 4.8배 높은 DPPH radical 소거활성을 보였으며 모 든 처리군 간에 유의적 차이가 있었다(p<0.05).

Hydroxyl radical 소거 활성의 경우 대조구는 16.89%로 나타났으며 모든 미세캡슐화 처리 시료는 대조구와 비교하 였을 때 높은 활성을 보였으며 유의적 차이(p<0.05)를 나타 내었다. MD+CD 처리구가 47.64%로 가장 높았으며 MD 처리구는 41.89%, CD 처리구는 37.50%로 각각 나타났다. 이러한 처리구의 항산화활성의 향상현상은 처리구의 수분용 해도 향상과 밀접한 관계가 있으며, curcumin을 gelatin으로 미세캡슐화한 경우 ABTS radical 소거활성이 3.2에서 29.5 μg vitamin C equivalents/mL로 상승하였다는 보고가 있다 (Gomez-Estaca et al., 2017). 이와 같은 현상은 미세캡슐화 과정에서 입자크기가 작아지면서 비표면적증가에 따른 반응 성향상에서도 기인되었다고 사료된다. Quercetin을 pullulan 과 Tween^® 80을 혼합한 피복물질로 캡슐화한 경우 in vitro 로 모형의 위(gastric)와 장(intestinal) 상태에서 소화과정에 서의 방출역학(release kinetics)을 기초로한 항 산화 수용력 으로 trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC)를 측정 한 결과 각각 4.65에서 24.56 mmol trolox/g bioactive로 7.90에서 19.63 mmol trolox/g bioactive로 증가하였다는 보 고가 있다(Aceituno-Medina et al., 2015).

미세캡슐화 처리에 따른 옥수수 수염 추출물의 tyrosinase 저해활성 측정 결과는 Table 4와 같다. Tyrosinase는 인체 내의 멜라닌 생합성경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단 계에 관여하는 효소로서 많은 미백 성분이 이 효소를 억제 하는 작용기전을 가지고 있다. 대표적인 tyrosinase 활성 억제물질로는 phenol compound, flavonoid, glycolic acid, ferulic acid, isoflavonoids 등으로 알려져 있다(Cabanes et al., 1994). 대조구는 7.16%로 낮은 활성을 보인 반면 처리 구는 39.35-40.42%로 보다 높은 활성을 보였다. 미세캡슐 화 시료 중 MD 처리구가 40.42%로 가장 높았으며, CD와 MD+CD 처리구는 유사한 값을 나타내었고, 대조구와 처리 구 간에 유의적 차이를 보였다(p<0.05). 처리구의 tyrosinase 저해활성의 향상현상은 처리구의 수분용해도 및 침투력 향 상과 밀접한 관계가 있다고 하였다(Ephrem et al., 2017).