다구찌 기법을 이용한 멸치 고압효소가수분해 공정의 최적화

본 연구에서 사용한 생멸치, Engralis japonica (체장 7.2±0.5 cm, 체중 2.7±0.4 g)는 2013년 3월에 제주도 해역 에서 어획한 것을 동해수산(Busan, Korea)에서 구입, 빙냉 운반하여 일정량씩 polyethylene film bag에 넣은 다음 냉 동고(-20°C, FC-1353 HMS, LG Electronics Inc., Seoul, Korea)에 저장하여 두고 실험에 사용하였다. 실험에 사용 된 복합효소는 대명상사(Seoul, Korea)로부터 구입한 상업 용 효소로 Novozymes (Bagsvard, Denmark)의 Alcalase^® 2.4 L와 Flavourzyme^TM를 1 : 5의 비율로 혼합하여 사용하 였다. 멸치 고압효소가수분해물과 품질 특성 비교를 위하 여 시판되고 있는 멸치액젓과 멸치어간장을 부천 시내 대 형 마트 및 인터넷 쇼핑몰에서 각각 구입하여 -20°C 이하 의 냉동고에서 보관하면서 분석용 시료로 사용하였으며, 실험에 사용된 분석용 시약은 모두 분석 시약급을 사용하 였다.

다구찌 방법은 직교배열표를 이용한 실험계획법으로 유 일한 해를 찾으려는 것보다는 품질과 비용의 최적해를 구 하려는 의도에서 출발한 것으로, 제품 및 공정 설계에서 가장 저렴한 비용으로 안정적이고 신뢰성이 높은 성능을 나타내는 인자의 조합을 찾는데 이용되며, 실험할 때 실제 사용하는 조건과 똑같이 잡음조건을 바꾸어 가면서 실험하 여 최적 조건을 찾는데, 이 점이 기존의 실험 계획법과 커 다란 차이점이다(Taguchi, 1986). 품질 특성의 목표 값을 유지하면서, 분산을 줄이는 인자에 대해 설정 값을 추출할 수 있다. 따라서 다구찌 방법은 제어 가능하고 영향력이 강한 인자를 찾아내어 이 인자들의 영향력을 최대로 하고 제어할 수 없는 잡음의 영향력을 최소로 하는 강건 설계 (robust design)를 할 수 있다.

다구찌 방법에서 개선을 위한 정도를 나타내는 측정치로 SN 비(ratio of signal to noise)를 사용한다. SN 비는 잡음 에 대한 제어 인자의 비를 나타내며 식 (1)과 같이 정의된 다(Taguchi, 1986).

본 연구에서 사용한 품질 특성은 크면 클수록 좋기 때문 에 망대특성(larger-the-better characteristics)을 이용했다. 망 대 특성을 갖는 SN 비는 식 (2)와 같다(Taguchi, 1986).

다구찌 방법에서 제어인자(control factor)는 최적 설계 조건 또는 최적 공정조건을 찾기 위하여 사용되는 인자로 서 온도, 압력 등과 같이 가장 영향이 큰 모수 인자로 분 산을 줄이기 위해 비용을 크게 상승시키지 않고 품질 개선 을 할 수 있는 인자다.

제어인자가 설정되면 다음엔 수준을 결정하고, 특성치에 영향을 주고 있으나 그 요인의 상태를 파악할 수 없으며, 이유는 알 수 없으나 품질 분산에 나쁜 영향을 주는 인자 로서 잡음인자(noise factor)를 선정하여 직교배열표에 의한 실험 설계를 한다.

직교배열표 선정은 제어인자의 수, 제어인자의 수준 수, 교호작용의 존재 여부를 고려하여, 내측배열은 제어인자와 각 수준을 보여주고 있고, 외측배열은 신호인자, 잡음인자 등의 조합으로 전체 실험의 반복수를 나타낸다. 동특성에 서는 신호인자와 잡음인자를 같이 고려하고, 정특성에서는 신호인자를 고려하지 않는다.

본 연구에서는 정특성 실험을 수행하였고 생멸치의 고압 효소가수분해 공정의 성능을 결정하는 가장 중요한 특성으 로 가수분해도(DH, %)와 nitrogen recovery (NR, %) 및 수율(%)을 각각 사용하였다. 이것에 영향을 주는 제어 인 자는 전 보(In et al., 2016)에서의 결과와 예비 실험을 통 하여 압력, 온도, 반응시간, 및 복합효소농도를 선택하였으 며, 각 제어 인자에 대한 수준은 3으로 하여 압력은 50, 75 및 100 MPa, 온도는 40, 50 및 60°C, 반응시간은 12, 24 및 48 h, 그리고 복합효소농도 0, 1 및 2%로 설정하여 Table 1의 내측배열에 나타내었다.

이 때, 직교배열, 자료분석 및 분산분석(ANOVA)은 다구 찌 기법에 기초한 MINITAB 16 software (Minitab, Inc., State College PA, PA, USA)를 사용하였다.

생멸치 효소가수분해물은 전 보(In et al., 2016)에서와 같 은 방법으로 제어 인자의 수준만 변경하여 제조하였다. 생 멸치 효소가수분해물은 원료 멸치와 물을 1:2 (w/w)의 비 율로 혼합하여 믹서기(HMF-3100S, Hanil, Seoul, Korea)로 2분씩 세 번 분쇄한 후에 homogenizer (T25, IKA, Staufen, Germany)로 16,000 rpm에서 5분씩 3번 균질화하였다. 균 질화된 멸치 분쇄물에 Alcalase^® 2.4 L: Flavourzyme^TM를 1:5 비율로 혼합한 효소를 원료 멸치 대비 0-2% (w/w) 첨 가하고 폴리에틸렌필름 포장지에 담아 완전밀봉한 후에 고 압조건(50-100MPa)에서 일정시간 효소와 반응시켰다. 고 압에서의 반응 후, 90-100°C에서 10-15분 동안 불활성하고 4°C에서 12시간 이상 숙성하여 지방층을 제거한 후에 여과 하여 -20°C 냉동고에서 보관하면서 분석용 시료로 사용하 였다.

생멸치, 시판 멸치어간장과 멸치액젓, 대조구 시료 및 고 압효소가수분해물의 일반성분은 식품공전(KFIA, 2009)에 따 라 수분은 상압건조법으로, 회분은 건식회화법으로, 조단백 질은 micro-kjeldahl 분해법으로, 조지방은 soxhlet법으로 정 량하였다. 원료 생멸치의 일반성분은 탄수화물 3.41±0.27%, 조단백질 15.72±0.43%, 조지방 1.85±0.19%, 조회분 3.99± 0.18% 및 수분 75.03±0.92%이었다.

염도는 salt meter (Master-S28M, Atago, Tokyo, Japan)를 수용성 고형분 함량(°Brix)은 master refractometer (Master- 3M, Atago, Tokyo, Japan)를 pH는 pH meter (Orion 4-star Plus, Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하 여 측정하였다. 아미노태 질소 함량은 Formol 질소 정량법 (KFIA, 2009; AOAC, 2000)과 TNBS법(Rutherfurd, 2010) 으로 측정하였고, 수용성단백질은 TP0300-1Kit (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 Lowry protein assay법을 통하여 측정하였다(Lowry et al., 1951). 가수분해도(Degree of hydrolysis, DH)는 식 (3)에 의해서 산출하였다.

여기서 h_amino는 효소가수분해물, h₀는 가수분해 전 시료에 서의 아미노태 질소 함량이고 h_total은 가수분해 전 시료에 서의 총 질소 함량이다. 수율(yield)은 식 (4)에 따라 산출 하였다.

여기서 h_hydrolysate는 고압효소가수분해물에서 측정한 총 질소 함량이고 은 가수분해 전 시료에서의 총 질소 함량이다. 유리아미노산 정량은 HPLC (Hewlett Agilent 1100-series, Hewlett-Packard Co., Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 분 석하였다. 사용된 컬럼은 C18 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm/Youngjinbiochrom, Korea)이었으며, 이동상은 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.8)와 45%(v/v) acetonitrile/ 45%(v/v) methanol 용액이 사용되었다. 시료는 o-phthalaldehyde (OPA)와 반응한 경우 형광검출기(450 nm emission, 305 nm excitation)로, 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC)와 반응시킨 경우 UV 검출기(338 nm)로 분석하였다. Nitrogen recovery (NR)는 Benkajul & Morrissey (1997)을 방법을 변형하여 식(5)에 의해서 산출하였다.

여기서 TA (total amino acid contents) 및 FA (free amino acid contents)는 각각 가수분해물에서의 총 아미노산 및 유리 아미노산 함량이다.

교호작용이 없다는 전제하에 4개의 제어인자에 대한 3 수준계 표준형 직교배열표 L₉ (3⁴)를 Table 1의 내측배열과 같이 설계하여 각 조건에서 고압효소가수분해물을 3회 반 복 제조하여 품질특성을 측정하고 목적변수로서 DH, NR 및 수율을 산출하였다.

먼저, 고압효소가수분해물에 대한 품질특성으로 측정한 평균 일반성분(조단백질 4.53±0.42%, 조지방 0.04±0.04%, 조회분 0.28±0.12% 및 수분 94.43±0.84%), pH (평균 6.41 ±0.41), 염도(평균 0.39±0.28)는 실험군별 95% 신뢰수준에 서 유의적인 차이를 보이지 않았으나 수용성 고형분 함량 을 나타내는 °Brix는 최소 4.47±0.12에서 최대 8.00±0.01으 로 실험군별 유의적인 차이를 나타내었다. 이러한 사실은 각 제어조건에 따라 가수분해 정도가 다르기 때문으로, Nilsang et al. (2005)이 fish soluble concentrate의 상업적 효소에 의한 가수분해를 최적화하는 경우에 온도, 반응시 간 및 효소농도를 조절변수로 설정하여 보고한 결과와 유 사한 경향을 보였다. 즉, 제어인자 설정 근거가 타당함을 확인할 수 있었다.

제어조건에 따른 9개 실험군과 액젓(시료 B) 및 어간장 (시료 A)에 대한 개별 유리 아미노산 및 총 유리 아미노산 함량에 대한 95% 신뢰수준에서 유의검정을 실시한 결과, 총 유리 아미노산 함량 및 유리 아미노산별로 각 9개 실 험군과 액젓(시료 B) 및 어간장(시료 A)에서 유의적인 차 이를 확인하고 Fig. 1에 대표적으로 세린의 경우만 나타내 었다. 총 유리 아미노산은 9개 실험군에서 모두 액젓 및 어간장보다 유의적으로 많이 생성되어 효소 및 고압처리가 전통적인 액젓 및 어간장 생산 공정을 개선할 수 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 풍미 또는 짠맛증진성분으로 알려 진(Schindler et al., 2011; Yun et al., 2015) glutamine, arginine, glysine 등과 lysine 및 tryptophan이 시판 멸치 어 간장 및 액젓보다 풍부하게 생성되었다. 이러한 결과는 Yun et al. (2015)이 어간장 생산 공정을 개선하여 짠맛증 진물질 생산 가능성을 제시한 보고와 일치하는 결과이다.

Fig. 1. Profiles of free amino acids of pressure-assisted enzymatic hydrolysates of raw anchovy and two commercially available anchovy sauce. *A: Changnyeong fish sauce, B: Myeolchi aekjeot (fermented anchovy sauce), 1-9: Experimental no. in Table 1, ^a-c: Means with different superscripts above the bars are significantly different. ^c*: Significantly different in groups (experiment no.).

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Table 1의 우측에는 실험설계에 따라 순차적으로 실험을 실시하여 산출된 목적변수의 값과 통계분석용 소프트웨어 Minitab의 실험계획법-다구찌 설계(Taguchi, 1986)를 이용 하여 산출된 망대 특성 SN비를 보여주고 있다. 여기서 외 측배열의 R1, R2 및 R3는 실험상 잡음인자(예, 원료 성분 등)에 대한 수준을 제어할 수 없어 3회 반복하여 측정하였 음을 의미한다.

설계변수에 대한 SN비의 반응표(data not shown)에 따른 델타 통계량에 의하면 목적변수인 DH와 NR의 경우에는, 압력, 혼합효소의 첨가량, 반응온도 및 반응시간의 순서로 영향을 미치며, 반면에 수율의 경우에는 반응시간, 복합효 소의 농도, 압력 및 반응온도의 순서로 영향을 미치는 것 으로 확인되었다.

Fig. 2는 각 설계변수의 수준 변동에 따른 SN비의 변화 로 직교배열에서 각 설계변수가 갖는 동일 수준의 SN비 평균값을 도시한 것으로 각 그래프의 가장 큰 값이 최적 수준을 의미한다. 또한, 점선은 목적변수별 SN비 전체 평 균을 의미한다. 따라서 SN비로 목적변수를 최대화하는 공 정조건을 결정하면, DH의 경우에는 압력 75-100 MPa, 반 응온도 60°C, 반응시간 12 h, 복합효소농도 1%이고, NR의 경우에는 압력 100MPa, 반응온도 50°C, 반응시간 12 h, 복합효소농도 1%이며, 수율의 경우에는 압력 100MPa, 반 응온도 60°C, 반응시간 12 h, 복합효소농도 2%이다.

Fig. 2. Means of SN ratios and optima of design variables (circles) according to degree of hydrolysis (DH, %), nitrogen recovery (NR, %) and yield (%), respectively. A: DH, B: NR, C: yields. *---: average of SN ratio.

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한편 Minitab의 분산분석 중 일반선형모형을 이용하여 각각의 특성치에서의 SN비에 대한 분산분석의 결과(Table 2), 분산분석표에서 DH와 NR의 경우에는 변동이 작은 반 응온도와 반응시간을 오차 변동으로 처리하였다. F 검정 결과, DH에 대한 압력과 혼합효소 첨가량의 F 값이 각각 42.12, 24.41이다. 그리고 압력과 혼합효소의 첨가량의 p 값이 각각 0.002, 0.006이다. 따라서 압력과 혼합효소의 첨 가량은 신뢰도 95%, 유의수준 5%에서 p 값이 0.05보다 작아 통계적으로 유의하였다. NR의 경우에는 유사한 경향 을 나타냈지만 수율의 경우에는 설계변수 모두가 p 값이 0.05보다 커서 통계적으로 유의함을 보여주지 못하였다. 이 러한 사실은 수율을 목적변수로 선정하는 것은 재고할 필 요가 있음을 보여준다.

3가지 목적 변수와 경제성 및 장치의 성능(온도 60°C와 압력 100MPa은 현 장비로서는 한계치)을 고려하여 최적 조건으로 압력을 75MPa, 반응온도 50°C, 반응시간 12 h, 복합효소농도 1%로 설정하여 예측한 값과 이 조건으로 3 회 반복 실험한 값을 비교하였다(Fig. 3). Fig. 3에서와 같 이 NR 및 DH의 경우에는 최적 조건에서 예측한 값과 실 험값이 매우 근사하였지만, 수율의 경우에는 95% 신뢰수 준에서 유의적인 차이를 보여 다구찌 실험 설계 분석의 타 당성을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 다구찌 설계 분석에서 수율을 목적 변수로 설정하기에 부족하다는 결과 와 일치한다.

Fig. 3. Comparison of predicted values (degree of hydrolysis, nitrogen recovery and yield) and experimental results at optimal condition (Pressure; 75 MPa, Temperature; 50°C, Time; 12 hrs, and Mixed enzyme; 1%). *Values are the means± SD of three determinations. ^a-dMeans with different superscripts above the bars are significantly different.

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도출된 최적 조건에서 제조된 생멸치 고압가수분해물과 시판 멸치 어간장 및 액젓의 품질특성으로 Table 3에는 일 반성분, pH, 염도 및 수용성 고형분 함량을 나타내는 °Brix 를 측정하여 나타내었고, Table 4에는 유리아미노산을 측 정하여 나타내었다.

Table 3에서와 같이 가수분해물의 염도는 0.73±0.01이지 만, 이를 수분 함량을 유사하게 농축한다는 가정 하에 계산 하면 염을 가하지 않고도 어간장 및 액젓과 유사한 단백질 함량의 생멸치 가수분해물을 생산할 수 있으며, 농축 여부 에 따라서 품질기준을 조절할 수 있으리라 판단하였다.

Table 4에서와 같이 고압효소가수분해물에서 풍미 또는 짠맛증진성분으로 알려진(Schindler et al., 2011; Yun et al., 2015) glutamine, arginine, glysine 등과 lysine 및 tryptophan 이 각각 2935.50, 2701.13, 1206.70, 3249.80 및 5323.76 mg/L으로서 시판 멸치 어간장 및 액젓에서 보다 총 량으 로 각각 3.1, 2.3배 이상 풍부한 것으로 나타나, 가수분해 물의 풍미증진제로서의 가능성을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 필수 아미노산의 경우에도 총량 기준으로 시판 멸 치 어간장 4배, 액젓보다 1.3배 더 풍부하였다. 유리 아미 노산 총 함량은 고압효소가수분해물 > 어간장 > 액젓의 순서로 많이 생성되었다. 고압효소가수분해물은 Table 3에 서의 조단백질 함량과 유사하여 질소 대부분이 아미노산의 형태로 존재함을 의미하며, 액젓 보다는 어간장이 숙성기 간이 길어 유리 아미노산이 풍부하게 생성된 결과로 판단 되었다.

고압에서의 효소가수분해에 대한 성능 개선 효과를 분석 하기 위하여 대조군으로 상압에서 혼합효소 2%를 가하여 30시간 동안 가수분해를 실시하여 가수분해물에 대한 총 질소, Formol법과 TNBS법에 의한 아미노태 질소와 Lowry법에 의한 수용성 단백질 내의 질소 함량을 측정한 후에 가수분해도를 산출한 결과, 상압에서의 효소가수분해 반응은 24시간 부근에서 종료되는 것으로 나타났으며, 최 대 가수분해도는 18±1.3%에 이르렀다. 최대 가수분해도를 기준으로 고압효소가수분해반응의 성능 개선 효과를 비교 한 결과, 최적 조건에서의 가수분해도는 27.47%로서 상압 효소가수분해의 DH 값인 18%±1.3%보다 52.6%의 개선 효과를 확인할 수 있었다.