재배 지역에 따른 산수유의 Loganin 함량과 분석법 검증

본 실험에 사용한 산수유는 한약 규격품으로 2015년 6월 한국생약협회를 통해서 국산 3종(전라남도 구례군, 경상북 도 의성군, 경기도 이천시)과 수입산 1종(중국산)의 씨가 제거된 건조과실을 각 6 kg씩 구입하여 사용하였다. 시료의 균질화를 위하여 600 g 소포장된 각 팩에서 100 g씩 각각 취한다음 한곳에 모아 혼합하였고, 액체 질소를 이용하여 급 냉동시켜 분쇄하였다. 분쇄한 각 시료는 100 g씩 소포장 후 -70°C 냉동고에 보관하며 실험에 사용하였다.

본 실험에서 사용된 loganin 표준품은 Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)의 것을 사용하였다. 추출용매와 표준품 제조 및 이동상에 사용한 용매는 HPLC용 용매를 사용하였다. 검량선 작성을 위해 표준품은 methanol에 녹 여 1 mg/mL이 되도록 고농도 표준용액을 제조한 후 단계 적으로 희석하여 11개 농도(0.03, 0.06, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 200 μg/mL)로 조제하였다. Loganin 함량을 구하기 위하여 표준용액의 크로마토그램에서 얻은 피크의 농도별 면적에 대하여 검량선을 작성하였다.

산수유의 loganin 추출 및 분석은 Du et al. (2008)과 Park et al. (2012)의 방법을 참고하여 분석 하였다. loganin 추출은 구례산 산수유를 이용하여 각 조건별로 3반복 이상 최적 추출조건 시험을 하였다. 최적 추출조건은 loganin 추 출에 영향을 미칠 것이라 생각되는 에탄올 농도(0-100%), 추출 용매량(25-200 mL) 및 추출시간(15-120 min)의 조건 을 달리하여 추출한 후 loganin함량을 분석하여 결정하였 다. 즉 산수유 건조분말 0.5 g을 정확히 칭량한 후 정해진 조건에 의해 초음파 추출(WUC-A22H, DAIHAN Scientific, Wonju, Korea)한 후 여과 및 정용하여 분석시료로 사용하 였다. 최종적으로 확인된 80% 에탄올, 50 mL, 초음파 추 출 30 min의 추출조건으로 3회 반복 시험하여 추출액을 만 들고 0.45 μm filter로 vial에 여과 후 HPLC/DAD로 분석 하였다. 함량은 표준용액 크로마토그램의 피크 면적을 통 하여 작성된 검량선에 의해 산수유 중 loganin의 농도를 산출하였다.

HPLC 분석조건은 Table 1에 요약하였다. 분석 컬럼은 X-Bridge C₁₈ (4.6×250 mm, 3.5 μm, Waters corporations, Millford, MA, USA)을 사용하였고, HPLC 장비는 Alliance (Waters e2695), UV/VIS detector (Waters 2996)을 사용하 였다. 데이터의 수집 및 처리는 Empower software program (Waters corporations)을 사용하였다. 이동상은 HPLC용 용 매를 사용하였고 A용매는 water, B용매는 acetonitrile을 사 용하였으며 사용 전 필터로 여과 후 탈기하여 사용하였다. 분석칼럼 유속은 0.6 mL/min, 분석시간은 40분, 이동상 gradient 조건은 Table 1과 같다. UV 분석 파장은 238 nm 에서 측정하였으며, 시료 시험용액은 20 μL를 주입하였다.

산수유 loganin함량 분석법의 검증은 대한민국약전 제 11개정(2014)과 AOAC 가이드라인(2002)에 기초하여 수행 되었다.

특이성(specificity)의 확인은 loganin 표준용액과 전 처리 한 구례산 산수유추출시험액을 HPLC로 분석하여 크로마 토그램상의 retention time과 UV spectrum을 비교하여 확 인하였다.

직선(linearity)은 loganin 표준용액을 1 mg/mL 농도로 제 조하고, methanol로 0.03-200 μg/mL 농도(11개 농도)로 3회 이상 반복 단계 희석 및 분석 후 농도에 대한 면적에 대 하여 검량선을 작성한 후 평균값을 이용하여 검량선을 작 성하여 직선성을 확인하였다.

검출한계(LOD, limit of detection)와 정량한계(LOQ, limit of quantitation)는 분석물질인 loganin의 검출 및 정량 이 가능한 최저 농도를 확인하기 위한 검출한계와 정량한 계를 HPLC/DAD로 검출해 얻은 바탕시험용액 크로마토그 램의 신호잡음비(signal-to-noise)값의 평균값과 표준 편차를 구하고, 표준편차에 각각 3과 10을 곱한 값을 평균값에 더 하여 검출한계와 정량한계를 구하였다.

산수유 loganin 성분 분석의 정확성을 위하여 표준품을 3가지 농도(50, 100, 200 μg/mL)로 제조하고, 시료 추출 시 2회 spiking하여 분석 후 시료에 대한 표준품의 농도별(μg/ g) 회수율(%)을 구하여 정확성을 시험하였다.

정밀성 검증은 구례산 산수유를 quality control 물질로 이용하여 하루에 독립적으로 5회 반복 실험하는 일내분석 을 수행하여 반복성을 계산하였고, 4일 동안 하루에 1회씩 2반복 이상 실험하여 이들 간 결과의 일치성을 계산하여 재현성을 시험하였다.

통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical package for the social science, Ver. 12, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를 이용하여 각 3회 이상 반복 실험하여 평균과 표준편차 를 산출하고 Duncan’s multiple range test를 한 후 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

특이성이란 공존이 예측되는 불순물, 간섭물 및 다른 구 성성분들의 존재 시 분석하고자 하는 목적성분을 정확하고 특이적으로 측정할 수 있는지 확인하는 것으로(AOAC, 2002), loganin 표준용액과 구례산 산수유추출액의 HPLC 크로마토그램을 비교하여 loganin peak가 분리되는지 확인 한 결과 Fig. 1과 같이 다른 물질과 간섭 없이 성분이 분 리 되었으며 표준용액과 산수유추출액의 peak 유지시간이 16.3분으로 일치하였다. 또한 표준용액과 시료추출액의 UV spectrum도 정확하게 일치 하는 것을 확인하였다(Fig. 1).

Fig. 1. HPLC chromatogram and UV spectrum of loganin standard solution (100 μg/mL) (A), Cornus officinalis extract (B).

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직선성의 성립은 검체 중의 분석대상물(지표성분)의 양 또는 농도에 대하여 측정반응이 직선적인 비례관계를 보이 는 정도로 기대하는 농도 범위 80-120%를 포괄하는 범위 를 검토하며, 0을 제외한 7개 이상의 농도 수준의 표준물 을 각 수준에서 3회 이상 반복 측정한 검량선(calibration curve) 작성 후 측정 평균값으로 얻어진 관계식으로 확인 된다(AOAC, 2002). Loganin 표준용액을 0.03-200 μg/mL의 11개 농도 수준으로 3회 반복 단계 희석 후 HPLC로 분석 하여 얻은 평균값으로 검량선을 작성하였으며 Fig. 2와 같 은 검량선을 나타내었다. 검량선의 상관계수(R²)는 1로 우 수한 직선성을 보였으며, 검출한계는 0.007 μg/mL, 정량한 계는 0.026 μg/mL 수준으로 나타났다(Table 2). 건조된 동 백꽃 및 금은화를 시료로 loganin을 포함한 iridoid 배당체 성분을 분석한 Song et al. (2006)의 연구에서는 검출한계 가 0.0015 μg/mL로 본 연구 보다 낮은 수준을 보였는데 이는 고감도 검출기인 mass spectrometric 검출기와 함께 모세관 고속액체크로마토그래피를 이용하였기 때문으로 사 료된다. 산수유를 시료로 loganin을 포함한 6개 성분을 고 속액체크로마토그래피를 이용하여 동시 분석한 Du et al. (2008)의 연구에서는 검출한계가 0.11-1.69 μg/mL, 정량한 계가 1.48-16.60 μg/mL의 범위를 보였는데 본 연구의 검출 및 정량 한계 값이 더 미량임을 보여 본 연구의 loganin 분석법이 미량농도까지 분석이 가능함을 입증할 수 있다. 또한 산수유 시료의 표준화를 위해 선정된 지표성분의 분 석을 위한 검출한계와 정량한계를 검증한 것으로 기능성 식품 연구에서의 활용성이 높을 것으로 사료된다.

Fig. 2. Calibration curve of loganin standard solution.

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분석과정의 정확성은 기존에 사용하는 정확성이 입증된 분석법에 의한 분석 값과 근적외부스펙트럼 측정법에 의해 예상한 값이 유사하다는 것을 표현하는 척도이다(Ministry of Food and Drug Safety, 2014). 따라서 본 연구의 정확 성 결과는 Table 3과 같이 loganin의 회수율(%)로 확인하 였다. RSD (Relative standard derivation)는 5% 이내였으 며, 농도별로 50 μg/g에서는 105.45%, 100 μg/g에서는 96.15%, 200 μg/g에서는 95.14%의 회수율을 보였는데 이 는 50 μg/g의 낮은 농도에서도 100%에 가까운 회수율을 보여 줌으로서 본 분석방법의 정확성을 검증하였다. 또한 loganin을 포함한 4개 성분을 동시 분석한 Zhao et al. (2007)의 연구에서 시료추출액에 알고 있는 농도의 표준품 을 spiking한 회수율이 101.8%로 본연구와 유사하게 100% 에 가까운 우수한 회수율을 보임으로 정확성을 입증 할 수 있었다.

정밀성이란 제시된 분석조건에서 같은 검체에 대해 일련 의 연속적인 분석으로 얻은 결과간의 유사함을 의미하는 것으로(Ministry of Food and Drug Safety, 2014), 본 연구 에서는 Table 4와 같이 intra-및 inter-day분석에서 RSD (%) 값이 3% 이내로 AOAC 가이드라인(2002)이 요구하는 5% 이하의 값을 보여 일내와 일간의 반복성과 재현성이 우수함을 보여주었다. Du et al. (2008)의 연구에서도 intra- 및 inter-day RSD값은 각 2.53%와 3.17%로 본 분석 방법의 결과와 유사함을 확인하였다.

본 연구의 loganin 분석방법의 검증과정을 통하여 HPLC/DAD 분석법이 산수유 중 존재하는 중요한 약리적 성분의 표준화를 위한 정량에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다. 또한 검증된 분석방법으로 재배 지역별 산수유의 loganin 함량을 측정한 결과 3.41-7.81 mg/g 범위의 함량을 보였다. 이는 중국산 산수유 보다 국내산 2종에서 더 높은 loganin 함량분석 결과를 보여줌으로서 본 연구의 loganin 분석법 검증을 통해 loganin 함량이 높은 국내산 산수유의 기능성 원료로서 산업적 가치가 우수함을 확인 하였다.