복분자 추출물의 기능성 원료 표준화를 위한 지표성분 Ellagic acid 분석법

복분자(Rubus occidentalis)는 전북 고창군에서 재배된 것 을 구입하여 냉동 보관하여 사용하였다. 복분자 중량 10배 의 용매를 첨가한 후 2시간 동안 농축 추출기(Cosmo 660, Kyungseo machine, Incheon, Korea)를 이용하여, 80°C에서 2회 가열 추출하였다. 추출물은 여과하여 농축한 후 동결 건조(PVTFD10R, Ilsinbiobase, Dongduchen, Gyeonggido, Korea)하여 사용하였다.

Ellagic acid(Analytical standard, purity 95%, Sigma Co. St. Louis, MO, USA) 표준품 약 5 mg을 메탄올 25 mL에 용해시킨 후 1 mg/mL로 만들어 표준원액을 제조하였고, 이를 메탄올로 희석하여 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 150, 200 μg/mL 농도가 되도록 표준용액을 만들었다. 제조된 표 준원액과 표준용액은 4°C에서 냉장보관 하였다.

복분자 추출물 0.1 g을 전처리 용매(EtOH: Distilled Water:HCl = 60 : 20 : 20) 10mL에 녹인 후 환류추출장치가 부 착된 water bath를 이용하여 90°C에서 가수분해 하였다. 가 수분해 용액은 실온에서 냉각하고 메탄올로 정용(100 mL) 하여 0.45 μm syringe filter로 여과한 용액을 시험용액으로 사용하였다.

복분자 추출물의 ellagic acid 분석은 HPLC(ACQUITY H-class, Waters, Co, Milford, MA, USA)를 이용하였으며, 분석용 컬럼은 Shiseido capcellpak C18 UG(5 μm, 4.6×250 mm, Shiseido, Tokyo, Japan)을 사용하였다. 이동 상으로는 0.1% phosphoric acid in water(A)와 methanol(B) 을 사용하였고, 1.0 mL/min의 유속으로 시료 10 μL를 주입 하여 분석하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다.

지표성분에 대한 분석법의 유효성 검증은 의약품 등 분석 법의 밸리데이션에 대한 가이드라인(KFDA, 2004)을 근거로 하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 회수율(recovery)을 통해 시험법을 검증하 였다.

특이성: Ellagic acid 표준용액과 복분자 추출물을 HPLC 로 분석한 뒤 크로마토그램상의 retention time과 비교하여 ellagic acid 피크가 분리되는지 확인하였다.

직선성 및 검출·정량 한계: 단계적으로 희석한 ellagic acid 표준용액을 HPLC로 분석하여 농도에 대한 면적에 대 하여 검량선을 작성하고, R²값을 확인하였다. 각 성분에 대 한 검출한계(Limit of Detection, LOD)와 정량한계(Limit of Quantification, LOQ)는 표준용액의 크로마토그램을 사용하 여 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하여 계산하였다.

LOD = 3.3×(standard deviation/slope of calibration curve) LOQ = 10×(standard deviation/slope of calibration curve)

회수율: 회수율은 알고 있는 농도(4.25, 8.50, 17.00 μg/ mL)의 ellagic acid 표준물질을 시료에 넣어 시험용액을 조 제한 후 분석에 의해 회수되는 양을 백분율로 환산하였다.

정밀성: 정밀성을 확인하기 위해 반복성과 재현성을 실 시하였다. 반복성은 1일 3회로 나누어 일내분석(intra-day) 을, 재현성은 1일 3회로 3일 동안 반복하여 일간분석 (inter-day)을 진행하였다.

특이성은 불순물, 분해물, 배합성분 등 여러 가지 다른 성분들이 혼합되어 있는 복분자 추출물 중 ellagic acid만을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는지를 확인하기 위하여 ellagic acid 표준용액과 복분자 추출물 중 ellagic acid의 retention time을 확인하였다. 그 결과 검출된 ellagic acid peak가 동일 시간대인 약 12분대에 검출되어 동일 물질임을 확인하였으며 시험용액에서 ellagic acid peak가 단일 peak 로 다른 peak와 완전히 분리됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2).

Fig. 2. HPLC chromatogram pattern of ellagic acid in extract from black raspberry. A) Ellagic acid standard B) Black raspberry extract.

Download Original Figure

검체 중 일정 농도 범위에 있는 ellagic acid의 양에 대 하여 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는지를 확인하기 위 하여 ellagic acid 표준물질의 직선성을 평가하였다. 표준검 량선은 Fig. 3과 같이 6.25-200 μg/mL 농도에서 상관계수 (R²)가 0.9999로 높은 직선성을 보였으며, 검출한계는 0.6 μg/mL, 정량한계는 1.9 μg/mL이었다. 이는 시료에 적용 할 경우 검출한계는 0.6 μg/mL 수준까지 검출이 가능한 것 을, 정량한계는 1.9 μg/mL 수준까지 정량할 수 있는 분석 물질의 최저 농도를 의미한다. Rakesh 등(Rakesh et al., 2012)은 ellagic acid 분석방법의 검증에서 R2은 0.998이었 고, 검출한계와 정량한계가 각각 0.66 μg/mL, 2.40 μg/mL 로 본 시험법이 검출한계와 정량한계 모두 낮은 수준까지 분석이 가능하여 지표성분 분석을 위한 검출한계와 정량한 계를 검증하였다.

Fig. 3. Calibration curve of ellagic acid standard.

Download Original Figure

회수율을 확인하기 위하여 일정 양을 시료에 넣은 후 분 석에 의해 회수되는 양을 확인하였다. Table 2에 나타난 바와 같이 ellagic acid의 회수율은 4.25 μg/mL 농도에서 97-100%, 8.50 μg/mL 농도에서 96-98%, 17.00 μg/mL 농 도에서 89-95%의 범위의 회수율은 보였다. Kim 등(Kim et al., 2012)은 ellagic acid 분석방법의 검증에서 89-97%의 회수율을 얻어 본 시험법과 유사한 결과를 보였다.

하나의 균일한 시료로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료 를 정해진 조건에 따라 반복 분석하였을 때, 분석물질에 대한 각각 측정치간의 근접성을 확인하였다. Inter-, intraday의 정밀도(RSD)를 측정한 결과는 Table 3와 같으며 inter-day의 정밀도는 0.28~1.96%이었으며, intra-day의 정밀 도는 0.69-2.49%이었다.

이상의 분석결과, 본 시험법의 유효성검증을 통하여 ellagic acid에 대한 상기 HPLC 분석법이 건강기능식품 기 능성 원료로 인증받기 위한 완숙된 복분자의 지표성분인 ellagic acid의 분석이 가능함을 확인하였다.