Pediococcus pentosaceus의 Multilocus Sequence Typing 분석에서 신규 Sequence Type의 확인

본 연구에 사용된 P. pentosaceus는 한국프로바이오틱스 은행(Seongnam, Korea)에서 총 12주를 분양받았으며, 이 균주들의 분리원은 ON-82A, ON-188은 양파, GO-005, GO-008은 파, SC27, SC12는 젓갈, RP-008, RP-003은 고 추, TA-027, TA-035는 귤, 그리고 SP-019, SP-026은 고구 마로 총 6종류의 분리원을 사용하였다.

P. pentosaceus로부터 genomic DNA를 분리하기 위하여 P. pentosaceus의 단일 집락을 Lactobacilli MRS 액체배지 (Difco, Detroit, MI, USA)에 접종하여 37°C에서 16시간 정치배양하였다. 배양액 3 mL을 16,100×g에서 1분간 원심 분리하여 균체를 수획하고, 상등액을 제거하였다. 이후 균 체에 1 mL의 TEN 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl)을 첨가하여 현탁하고, 원심분리 하여 배지성분을 제거하였다. SET 완충용액(20% sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 50 mM EDTA) 500 μL를 첨가하 여 현탁하고, 50 μL의 lysozyme (60 mg/mL in TEN 완충 용액, w/v)과 3 μL의 RNase A용액을 첨가하여 37°C에서 1시간동안 반응시켰다. 이 반응 용액에 25 μL의 SDS (25%, w/v)와 20 μL의 proteinase K를 첨가하여 조심스럽 게 혼합하고, 37°C에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후, AccuPrep Genomic DNA Extraction kit (Bioneer, Daejeon, Korea) 내의 GC binding buffer 400 μL를 첨가하여 60°C 에서 10분간 반응시키고, 200 μL의 iso-propanol을 첨가하 여 조심스럽게 혼합하였다. 반응액을 column tube에 옮겨 서 원심분리를 통하여 DNA를 column에 부착시키고, 500 μL의 washing buffer 1과 washing buffer 2를 순차적으로 첨가하여 순수하게 DNA만을 남긴 후, 50 μL의 멸균 3차 증류수로 DNA를 용출하였다.

P. pentosaceus의 MLST 분석을 위한 PCR은 상기 조건 으로 분리된 genomic DNA를 template DNA로 사용하였 고, Table 1에 나타낸 7개의 marker 유전자(gyr, pyc, pgm, leuS, gln, dal, pgi)를 증폭시키기 위한 primer를 제작하여 PCR을 수행하였다. PCR은 AccuPrep PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 최종 부피가 20 μL가 되도록 하였고, My Cycler (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA, USA)로 반응시켰으며, PCR 조건은 94°C에서 2분동안 1 cycle, 95°C에서 20초, 56°C에서 30초, 72°C에서 30초 조 건에서 35 cycle, 그리고 마지막 단계로 72°C에서 7분간 반 응시켰다. PCR 산물의 염기서열 결정은 Macrogen사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer를 이용하여 수행하였다. 분석된 염기서열의 homology 분석은 BioEdit program (Tom Hall Ibis Biosciences, Carlsbad, CA, USA)을 이용하였고, 염기서열의 상동성은 Clustal X (http:/ /www.clustal.org/clustal2)와 Mega 5 program (Center for Evolutionary Functional Genomics, The Biodesign Institute, Tempe, AZ, USA)에 의해 phylogenetic tree를 작성하였다.

P. pentosaceus의 MLST 분석을 위한 primer와 각각의 대립 유전자들을 Table 1에 나타내었다. MLST 분석을 위 한 marker 유전자로는 gyrB, pyc, pgm, leuS, glnA, dalR, pgi 등 총 7개를 사용하였는데, 각각의 marker 유전자들은 5-10개의 대립 유전자들을 지니고 있었다(PubMLST, 2015). 분양받은 12개의 균주에 대한 MLST marker 유전 자들을 증폭하여 agarose gel 전기영동한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 사용된 12균주 각각에 대하여 모든 marker 유 전자들이 증폭이 되어 전기영동 상에 나타났으나, pgm 유 전자를 제외한 6개의 marker 유전자의 크기는 PubMLST database (PubMLST, 2015) 상의 크기와는 상이한 것으로 나타났다. 그러나 이들 12균주 중에서 6균주(ON-82A, ON-188, GO-005, GO-008, RP-003, RP-008)를 선정하여 marker 유전자들에 대한 염기서열을 분석한 결과 증폭된 유전자는 해당 marker 유전자인 것으로 판명되어 MLST 분석에 이용하였다.

Fig. 1. Agarose gel electrophoresis of MLST for P. pentosaceus strains. M, 100 bp DNA ladder; 1, Pgi; 2, Pgm; 3, Pyc; 4, GyrB; 5, DalR; 6, GlnA; 7, LeuS.

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분석에 사용된 6균주의 MLST marker 유전자의 대립 유 전자 종류를 결정하기 위하여 해당 균주의 marker 유전자 와 현재까지 알려진 대립 유전자들의 염기서열을 이용하여 phylogenetic tree를 작성한 결과는 Fig. 2에 나타내었고, 이 결과에 따라 결정된 sequence type을 Table 2에 정리하였 다. 분석된 6균주 모두는 dalR 유전자는 5번 대립 유전자, glnA 유전자는 4번 대립 유전자, gyrB 유전자는 3번 대립 유전자, leuS 유전자는 5번 대립 유전자, pgi 유전자는 4번 대립 유전자, pyc 유전자는 6번 대립 유전자를 동일하게 지니고 있었으나, pgm 유전자의 경우에는 ON-188 균주의 경우 6번 대립 유전자를 지니고 있었고, 다른 균주들은 2번 대립 유전자를 지니고 있었는데 이를 이용하여 sequence type을 결정한 결과 기존의 sequence type과 일치하지 않는 새로운 sequence type으로 확인되었다. 따라서 ON-188 균 주의 sequence type을 18번으로, 나머지 균주들의 sequence type을 19번으로 지정하였다(PubMLST, 2015).

Fig. 2. UPGMA dendrograms for 6 P. pentosaceus isolates sequenced for MLST.

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Martino et al. (2013)은 여러 종류의 분리원으로부터 29주의 P. pentosaceus 균주를 분리하여 표현형적 특성과 bacteriocin 생산 여부를 조사하였고, MLST 분석을 통하여 17개의 sequence type을 확인하여 gyrB 유전자는 6개, pyc 유전자는 9개, pgm 유전자는 8개, leuS 유전자는 10개, glnA 유전자는 5개, dalR 유전자는 10개, pgi 유전자는 9 개의 대립 유전자가 존재함을 보고하였다. 또한 sequence type간의 관계를 조사하여 MLST 분석에 사용된 7개의 target 유전자는 유전자 내 재조합이 발생하지 않았지만 유 전자간 재조합이 광범위하게 발생되었음을 확인하였고, sequence type과 분리원간에는 높은 상관관계가 있어 같은 유전적 계통에 속하는 sequence type은 동일한 분리원으로 부터 유래됨을 밝힌 바 있다.

본 연구에서 새롭게 밝힌 sequence type 18은 dalR 유전 자의 5번 대립유전자, glnA 유전자의 4번 대립유전자, gyrB 유전자의 3번 대립유전자, leuS 유전자의 5번 대립유 전자, pgi 유전자의 4번 대립유전자, pgm 유전자의 6번 대 립유전자, pyc 유전자의 6번 대립유전자가 존재하는 것으 로, sequence type 18인 균주는 양파에서 분리된 ON-188 균주 밖에 존재하지 않아 sequence type과 분리원과의 상 관관계를 분석할 수 없었다. Sequence type 19는 dalR 유 전자의 5번 대립유전자, glnA 유전자의 4번 대립유전자, gyrB 유전자의 3번 대립유전자, leuS 유전자의 5번 대립유 전자, pgi 유전자의 4번 대립유전자, pgm 유전자의 2번 대 립유전자, pyc 유전자의 6번 대립유전자가 존재하는 것으 로, 총 5균주 중에서 1균주는 양파로부터, 2균주는 고구마 로부터, 나머지 2균주는 파로부터 분리된 것으로 다양한 분리원에 존재하는 것으로 나타났다.

현재까지 P. pentosaceus 균주의 MLST 분석은 Martino et al. (2013)이 수행하여 17개의 sequence type을 확인한 것을 제외하면 본 연구가 유일하며, 본 연구를 통하여 17 개의 sequence type 이외에 추가로 2개의 sequence type이 존재한다는 것을 밝힘으로써 P. pentosaceus의 분류 및 추 적을 위한 유전자 지문의 다양성을 확인할 수 있었다. P. pentosaceus 이외의 다른 유산균에 대한 MLST 분석의 최 근 연구들을 보면, Sun et al. (2015)은 중국과 몽골의 발 효 유제품으로부터 분리한 L. helveticus의 population structure를 MLST 분석을 기반으로 한 연구에서 총 11개 의 유전자를 분석한 바 있다.

본 연구결과로 MLST 분석법은 매우 간단하고 신속한 방법으로 미생물 분류 및 추적을 위한 유용한 유전자 지문 법인 것으로 확인되었으며, P. pentosaceus의 경우 6균주를 대상으로 MLST 분석을 한 결과 지금까지 알려져 있던 17 개의 sequence type 이외에 추가로 2개의 sequence type이 밝혀진 바, 보다 많은 균주를 대상으로 MLST 분석을 할 경우 아직까지 밝혀져 있지 않은 sequence type을 확인할 수 있을 것으로 판단된다.