발효명일엽의 품질특성

Quercetin, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)은 Sigma 사(Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO, USA), HPLC 용 매는 J.T.BAKER사(Mallinckrodt Chemicals, Hazelwood, MO, USA), 여과지(No.2)는 Whatman(Springfield Mill, Huddersfield, UK)에서 구입하여 사용하였다. MRS Broth 와 MRS Agar는 Becton Dickinson 사(Sparks, MD 21152, Franklin Lakes, NJ, USA) 구입하여 사용하였다. 탄닌산은 삼천사(Samchun Pure Chemical, Pyeongtaek, Korea)에서 구입하였다.

본 실험에 사용한 발효명일엽은 Fig. 1과 같이 제조하여 사용하였다. 먼저 Lm(Leuconostoc mesenteroides KCCM 40709), Lp(Lactobacillus plantarum KCCM 12116), Ls (Lactobacillus sakei KCCM 40264)를 이용한 발효명일엽을 제조하기 위해서 명일엽 및 말토덱스트린, 그리고 효모추 출물을 이용하여 배지를 제조하고 121°C에서 15분간 가압 멸균을 한 후 무균상에서 냉각 하였다. 초기 균수를 맞추 기 위해 먼저 MRS 배지로 Lm, Lp, Ls를 배양하여 각 균주 별 스타터를 전체 명일엽배지에 각각 0.43%(w/w), 0.90%(w/ w), 0.50%(w/w) 접종한 뒤 배양기에서 균주별 생육적온 (26°C, 30°C, 37°C)에서 배양하였다. 이 때 각 균주별 배양 기는 생육적온(26°C, 30°C, 37°C)에서 24시간동안 배양시 켰을 때 최대 균수를 나타내었다. 배양이 끝난 발효물은 pH 및 산도를 측정한 후 급속동결기에서 -80°C로 24시간 동결 시킨 뒤 동결건조기를 사용하여 건조 및 분쇄 후 실 험에 사용하였다.

Fig. 1. Manufacturing process of fermented angelica leaves.

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건명일엽 및 발효명일엽 추출물은 시료인 각각의 건명일 엽(dried angelica leaves), 공실험구(Blank), Lm 발효명일엽, Lp 발효명일엽, Ls 발효명일엽 각 20 g에 80% EtOH 200mL을 넣고 2시간 동안 환류추출 후 여과지(No. 2)로 여 과하는 과정을 3회 반복하여 추출한 추출물을 모아 농축 기(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 2배로 진 공감압 농축하여 각각 DA, Blank, ALm, ALp 그리고 ALs로 하였다. 감압농축으로 에탄올을 증발시킨 후 은박도 시락에 남은 추출액을 담아 급속동결기에서 -80°C로 동결 시킨 후 동결건조기를 이용하여 추출건조물을 제조하였다.

AOAC법(AOAC, 1995)에 따라 수분은 105°C 상압건조 법, 조지방은 soxhlet 추출법, 조단백은 semi-micro kjeldahl 법(N×6.25), 조회분은 550°C 회화법, 조섬유는 H₂SO₄-KOH 법으로 정량 하였다. 탄수화물은 100에서 수분, 조지방, 조 단백, 조회분, 조섬유를 뺀 값으로 하였다.

관능평가용 요구르트의 제조는 Choi(2009)와 같이 행하 였다. 12% 탈지분유를 90°C에서 30분간 살균한 후 무균상 에서 냉각을 시켰다. 냉각한 탈지분유 배지에 플레인 모닝 프로바이오틱스(Duolac, Cell Biotech Inc., Gimpo, Korea) 를 별도의 배양없이 직접 스타터로 접종하여 37°C에서 24 시간 발효시켰다. 발효가 끝난 요구르트는 냉장고에서 4°C 보관하여 관능 평가에 사용하였다.

관능평가용으로 제조한 요구르트에 DA, Blank, ALm, ALp 그리고 ALs를 각각 0.5% 첨가하여 homogenizer로 균 질화 시킨 후 식품생물공학과 실험생 20명을 예비실험을 통 해 훈련시킨 후 검사원으로 하여 색(color), 맛(taste) 및 전체 적인 기호도(overall acceptability)에 대하여 최저 1점, 최고 9점의 9단계 기호척도법으로 평가하였다(Kang, 2007).

건명일엽과 발효명일엽의 맛의 차이를 객관적으로 확인하 기 위해 미각 센서(taste sensor)를 이용한 맛 분석기(Insent, 5-1-1 Onna, Atsugishi, Kanagawa-Pref., Japan)를 사용하여 측정하였다. 건명일엽과 발효명일엽을 관능검사와 같은 방 법으로 제조한 후 3000 rpm에서 15분간 원심분리한 상등 액을 시료로 사용하였다. 맛 분석기에 시료를 35 mL씩 넣 어 4회 맛을 측정 한 후 1회차에 측정한 값을 제외한 나 머지 값의 평균을 이용하여 나타내었다. 측정 항목으로는 감칠맛(umami), 쓴맛(bitterness), 떫은맛(astringency), 짠맛 (saltiness), 신맛(sourness)을 분석하였는데 센서의 전극으로 측정된 전위차 값을 다시 맛의 수치로 변환시켜 결과로 나 타내었으며 맛의 수치의 차이는 사람이 맛의 차이를 인지 할 수 있는 맛 성분의 농도 변화를 나타낸다.

전자공여능(Electron Donating Ability, EDA)은 시료에 대한 DPPH(2,2-Diphenyl -1-picrylhydrazyl)의 전자공여 효 과로 시료의 환원력을 측정하는 방법으로 Su(2011)의 방법 을 변형하여 측정하였다. 농도별 희석한 시료추출물을 1.4mL씩 분주하고, 다시 여기에 150 μM DPPH(59.145mg/ mL in MeOH) 용액 2.1mL를 첨가하여 섞은 다음 실온에서 30분간 반응시키고 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Korea)를 이용하여 518 nm에서 흡광도를 측정하 였다. 대조군으로는 Ascorbic acid(Sigma Chemical Co. St. louis, MO, USA)를 사용하였다.

SA : sample absorbance

CA : control absorbance

페놀성 화합물중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것 으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Kwak(2008) 의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 1 mg/mL 농 도로 methanol에 용해시킨 시료에 50 μL와 1 N-NaOH 50 μL, diethylene glycol 1 mL를 혼합하여 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 화합물의 양은 루틴의 최종 농도가 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05 mg/mL이 되도록 하여 위와 같은 방법으로 반응시키고 420 nm에서 흡광도를 측정한 후 표준정량선을 작성하여 구하였다.

건명일엽과 발효명일엽의 게르마늄 분석을 위해 시료 2 g 을 테프론 비이커에 취해 perchloric acid 7 mL과 질산 10 mL을 넣어준 후 150°C에서 분해하였다. 분해 중 흰 연 기가 나면 질산 10 mL을 넣어준 후 계속 분해하였다. 시료 가 무색이 될 때까지 가열한 후, 1mL이 될 때까지 농축을 시킨 후, 3차 증류수로 20mL로 정용하고 여과한 후 ICPOES( Optima 8300, Perkinelmer, Waltham, UA, USA)를 이용 하여 분석하였다.

세포 생존율 분석을 위해 대장암세포주인 HT-29와 폐암 세포주인 A549를 5×10³ cells/well로 96 well plate에 24시 간 배양하여 plate에 부착시킨 후, 발효명일엽 추출물을 각 각의 농도로 희석하여 첨가한 후 24~48시간동안 더 배양 하였다. 여기에 cck-8(Dojindo) 용액 10 μL를 첨가한 후 1~4 시간동안 CO₂ incubator에서 더 반응시켰다. 반응이 끝난 후 ELISA reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정 하였 다(Dong, 2006).

실험결과는 SPSS package(release 8.01, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 mean±SEM로 표시하였고, 평균값의 통 계적 유의성은 SAS system(2002)을 이용하여 p<0.05 수준에 서 Duncan's multiple range test에 의해 검정하였다.

발효명일엽의 일반성분을 측정한 결과는 Table 1과 같았 다. 수분함량, 조지방, 조단백질, 조회분, 조섬유, 탄수화물 의 함량들이 대부분 유산균 비접종 시료(Blank)와 발효명 일엽 시료들 간에 큰 차이가 없어서 발효에 의해서 명일엽 에 함유된 영양성분의 함량이 변화하지는 않았음을 알 수 있었다.

식품소재로서의 관능적 적합성을 보기 위해 호상요구르트 에 발효명일엽을 0.5%씩 각각 첨가하여 색(color), 맛(taste) 및 전체적인 기호도(overall acceptability)등을 비교 한 결과 Table 2와 같았다.

0.5%의 발효명일엽을 첨가했을 경우 Table 2에서 보는 바와 같이 색에서는 유의적으로 차이가 없었으며, 맛에서 는 ALp가 3.70으로 ALm과 ALs과 유의적인 차이는 없었 다. 전체적인 기호도도 맛과 마찬가지로 유의상으로 차이 가 없다고 나타났다. 발효명일엽 첨가구들은 건명일엽 첨 가구에 비하여 맛이나 선호도에 있어서 유의적으로 우위에 있어서 적용이 보다 수월할 것으로 예상되었다.

객관적으로 발효명일엽들의 맛을 비교 측정하기 위하여 맛분석기(taste sensing system)로 건명일엽과 비교하여 분 석하였다. 0.5% 농도로 각 시료를 분석한 결과는 Table 3 와 같았다. 건명일엽에 비해 ALp 및 ALs 발효명일엽들은 쓴맛이 유의적으로 줄어들었으며, 신맛이 좀 더 강하였다. 감칠맛은 ALm 첨가구의 경우 6.06으로 ALp, ALs 첨가구 보다 높았으며, 무첨가구인 요쿠르트와 유의적으로 차이가 없는 결과를 나타내었다. Table 2의 관능평가의 결과와 연 계해 볼 때 발효명일엽 첨가구들은 감칠맛이 증가하지는 않았지만 신맛의 증가와 쓴맛의 감소로 전체적인 기호도가 상승하였음을 알 수 있었다.

DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼은 반응계에 서 전자를 공여 받으면 고유의 청남색이 엷어지는 특성이 있는데 건명일엽 추출물과 발효명일엽 추출물의 DPPH 라 디칼 소거능을 측정한 결과는 Table 4와 같았다. Table 4 에서 명일엽의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과를 보면 명 일엽의 농도가 높을수록 항산화 효과는 강하다는 것을 알 수 있었다. 발효명일엽 추출물인 ALm, ALp, ALm은 1000 ppm 수준에서 대조군인 ascorbic acid 12.5 ppm보다는 좀 더 낮은 수준의 라디칼 소거능을 보여주었으나, ALm의 경우 1000 ppm의 농도에서 건명일엽 추출물보다 높은 라디 칼 소거능을 보여주었고, 500 ppm의 농도에서는 ALp가 더 높은 활성을 보여주었다. 그러나 250 ppm이하에서는 발효명 일엽 추출물과 건명일엽 추출물의 활성이 유의적으로 차이 가 없는 것으로 나타났다. 유기농 케일과 일반 케일은 100 ppm농도에서 각 51.5%, 46.8%의 라디칼 소거능을 보여 준다는 다른 논문결과(Lee, 2011)를 보았을 때 명일엽의 라 디칼 소거능 활성은 케일에 비해 낮은 것으로 보여진다.

총 플라보노이드의 함량 분석방법으로는 질산알루미늄법, 염화알루미늄법, 2,4 dinitrophenylhydrazine법, diethylene glycol법 등 플라보노이드의 기본 구조에서 C-ring의 작용 기와 반응하여 색을 띄는 특성을 이용하는 비색 방법이 있 다. 최근 개발된 diethylene glycol법은 총 플라보노이드 함 량을 분석하는 방법으로 단순하고 플라보노이드 기본구조 를 갖는 화합물이 반응하여 노랑색을 띄는 특성을 이용하 여 분석한다(Kwak, 2008). 각 시료 추출물에 대하여 mg당 총 플라보노이드 함량을 diethylene glycol 비색 방법을 응 용하여 평가한 결과는 Table 5와 같다. 각 추출물별 Blank, ALm, ALp, ALs의 플라보노이드 함량과 항산화 활성과의 관련성을 검토하기 위해 추출액의 총 플라보노이드 함량을 평가한 결과 Blank에 비하여 발효명일엽 모두 플라보노이 드 함량이 높은 것으로 조사되었다. 따라서 발효명일엽의 생리활성은 유산균 발효산물에 의한 영향일 가능성이 높을 것으로 예측되었다. 국내산 식용식물중의 총 플라보노이드 함량을 분석한 결과를 살펴보면 국내 시판되는 일부 다류 의 경우 홍차, 인삼차, 녹차, 한차의 플라보노이드 함량은 각각 16.75, 3.29, 6.72, 6.06 μg/mg이며, 섬고사리 잎, 눈개승 마 잎, 물엉겅퀴 잎 추출물은 각각 16.75, 16.47, 13.30 μg/mg 으로 보고되었다(Lee et al., 2005). 이들 결과들과 비교해 볼때 발효명일엽은 상당히 많은 플라보노이드를 함유하고 있는 것으로 나타났다.

게르마늄은 주기율표에서 C, Si, Sn, Pb와 함께 4B족에 속하는 원자번호 32번인 원소로서 1886년 독일의 Winkler 가 argyrodite라는 광석에서 최초로 발견하였으며, 무기물인 GeO₂에서 합성되어 Ge-132로 불려지게 되었다. 게르마늄 은 항암효과, virus 감염치료와 rheumatics성 질환 및 노인 성 골다공증 치료효과, 박테리아 살균효과, 중금속 해독작 용(Park, 2003), 항종양효과, 항돌연변이 효과, natural killer 세포 및 대식세포의 활성화를 포함하는 면역강화 작 용, 해열 및 진통 등의 다양한 약리효과가 있는 것으로 밝 혀졌다(Lee et al., 2005).

건명일엽과 발효명일엽의 게르마늄 함량에 대한 결과는 Table 5와 같다. 명일엽에는 0.3 mg/kg의 게르마늄이 함유 되어 있다고 다른 논문에서 나타나고 있는데(Kim et al., 1992), 실험결과 건명일엽에 게르마늄은 0.012 mg/kg이 포 함되어 있었으나, Blank와 발효명일엽에 대해서는 게르마 늄이 검출되지 않았다. 그 이유는 명일엽이 자란 토양의 게르마늄 함량이 달라 그에 영향을 받은 것으로 판단되며, 발효명일엽의 경우 명일엽 배지를 만드는 과정에서 건명일 엽의 함량이 적었기 때문이라고 판단된다. 즉 게르마늄은 발효명일엽의 생리활성과는 관련이 적은 것으로 나타났다.Table 6

세포증식 및 생존능력을 측정하는 CCK-8 assay 실험의 결과는 Fig. 2 & Fig. 3과 같았다. Fig. 2는 폐암세포주인 A549에 건명일엽 추출물과 발효명일엽 추출물을 넣고 24 시간 배양한 결과인 (A)와 48시간이 지난 후 결과인 (B)를 나타내었다. (A)를 보면, DA와 ALs는 전 농도 구간에서 전혀 암세포 증식억제 효과를 보이지 않았으며, ALm은 200 ppm의 수준에서만 암세포 증식억제 효과를 나타내었 으며, ALp의 경우 농도의존적으로 증식억제 효과를 나타 내었다. (B)를 보면, DA와 Blank, ALm, ALs는 모두 폐암 세포에 대한 성장억제 효과를 나타내지 않았으나, ALp는 48시간에서 24시간에서보다 더 강하게 농도의존적으로 폐 암세포 억제효과를 나타내었으며 특히 400 ppm에서는 45%의 강한 억제효과를 나타내었다. 신선초와 신선초박은 A549 암세포에 대해 항암효과가 전혀 나타나지 않았다는 선행연구 결과로 볼 때(Kwon, 2004), 이번 실험과 유사한 결과를 나타내었다고 보여지며 다만 ALp의 경우는 명일엽 때문이 아니라 균 자체의 발효 생성물 때문에 폐암세포에 대한 억제효과를 보인 것으로 판단된다.

Fig. 2. Inhibitory effects of the fermented angelica leaves extracts on lung cancer cell line (A549). ¹⁾Dried angelica leaves extract ²⁾The extract of angelica leaves without inoculation ³⁾The extract of angelica leaves fermented with Leuconostoc mesenteroides ⁴⁾The extract of angelica leaves fermented with Lactobacillus plantarum ⁵⁾The extract of angelica leaves fermented with Lactobacillus sakei

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Fig. 3은 대장암세포주인 HT-29에 대한 실험결과로, (A) 를 보면 Blank와 ALs은 대장암세포 성장억제효과를 나타 내지 않았으나, DA과 ALm, ALp의 경우 대장암세포 성장 억제효과를 나타내었다. Fig. 3의 (B)를 보면, DA와 ALm 은 농도의존적으로 대장암세포 성장억제효과를 나타냈다. Blank의 경우 200 ppm이하에서는 농도의존적으로 암세포 억제를 하였으나 400 ppm에서는 오히려 암세포를 성장시 켰으며, ALp는 24시간에서 성장이 억제되었던 대장암세포 가 조금 더 성장이 되었고, ALs는 400 ppm을 제외하고 200 ppm까지는 농도의존적으로 암세포성장을 억제시켰다. 명일엽이 대장암세포의 성장을 억제시킨다는 결과는 신선 초즙을 이용해 대장암세포의 성장을 억제시켰다는 논문 (Jung, 2008)과 같았다.

Fig. 3. Inhibitory effects of the fermented angelica leaves extracts on colorectal cancer cell line (HT-29). ¹⁾Dried angelica leaves extract ²⁾The extract of angelica leaves without inoculation ³⁾The extract of angelica leaves fermented with Leuconostoc mesenteroides ⁴⁾The extract of angelica leaves fermented with Lactobacillus plantarum ⁵⁾The extract of angelica leaves fermented with Lactobacillus sakei

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즉 폐암세포주인 A549의 경우 ALp로 발효시킨 명일엽 이 폐암세포 성장억제효과가 400 ppm일 때 48시간에서 45%로 강한 억제효과를 나타냈으며, 대장암세포주인 HT- 29의 경우는 DA가 22%의 암세포 성장억제 효과가 있긴 했으나 발효명일엽 추출물인 ALm(45%)과 ALs(37%)가 더 강한 대장암세포 성장억제 효과를 나타내었다.