매실 첨가 막걸리의 이화학적 특성 및 항균/항산화 특성 연구

막걸리 양조에 사용한 쌀은 2022년 경기도 이천시 이천 남부농협 쌀 조합 공동사업법인에서 도정한 백미를 구입하 여 사용하였고 매실 농축액은 가담농원 영농조합법인에서 구매하여 사용하였다. 발효제로는 입국(Fermentation Plus, Seoul, Korea)과 누룩(Korea Fermentation Co., Hwaseong, Korea), 한국발효주식회사)을 사용하였다. 효모는 시판 La Parisienne (S.I. Lesaffre, France)를 사용하였다.

먼저 입국 70 g에 효모 0.56 g, 물 105 mL를 넣고 23°C에 서 48시간 발효시켜 주모 담금을 실시하였다. 이후 백미 140 g을 수세하고 2시간 동안 침지한 후 30분간 물빼기를 하고 2시간 증미한 후 실온에서 30분간 냉각시켰다. 증미한 백미와 입국 140 g, 물 420 mL를 앞서 주모 담금한 밑술에 넣고 23°C에서 24시간 발효시켜 1단 담금을 진행하였다. 24시간 발효 후, 백미 700 g을 1단 담금과 같은 방법으로 처리 후, 물 1050mL를 1단 담금한 밑술에 첨가하여 2단 담금을 실시하였다. 매실농축액은 2차 담금 시 쌀 무게 기 준 1, 3, 5%를 첨가하여 진행하였다. 총 15일간 발효를 진 행하면서 2일 간격으로 생성된 발효 생성물을 분석하였다.

백미 350 g을 수세 후, 2시간 동안 침지한 후 30분간 물 빼기를 하고 2시간 동안 증미한 후 실온에서 30분간 냉각 시켰다. 증미한 백미와 누룩 7 g, 효모 2.8 g, 물 525mL을 넣어 23°C에서 24시간 발효시켜 1단 담금을 실시하였다. 24시간 발효 후, 백미 700 g을 1단 담금과 같은 방법으로 처리 후, 누룩 14 g, 물 1050 mL를 1단 담금한 밑술에 첨 가하고 23°C에서 발효시켜 2단 담금을 진행하였다. 매실농 축액은 2단 담금 시 쌀 무게 기준 1, 3, 5%를 첨가하여 진행하였으며 총 7일간 담금을 진행하면서 2일 간격으로 생성된 발효 생성물을 분석하였다.

총산도는 국세청 주류분석규정(NTS, 2010)에 따라 여과 된 시료 10mL에 혼합지시약(B.T.B & N.R)을 2-3방울을 가하고 0.1 N NaOH로 중화 적정하였으며 적정치 값을 초 산(%)으로 환산하였다. pH는 pH meter (Ecomet pH mV TEMP Meter P25, iSTEK, Korea)로 측정하였다.

에탄올 함량은 국세청 주류분석규정(NTS, 2010)에 따라 원심분리(4000 rpm, 20분)한 술덧 100mL를 메스실린더에 취하고 15mL의 물로 2회 씻은 액을 합쳐 500 mL 삼각플 라스크에 옮긴 후 소포제를 첨가하였다. 삼각 플라스크를 증류장치에 연결하고 증류하면서 100mL 메스실린더에 증 류액이 70mL가 되면 전원을 차단하고 100 mL가 되도록 증류수로 채워주었다. 내용물을 잘 혼합한 다음 density meter (DAMA35 version3, Anton paar, Austria)로 알코올 함량을 측정하였다.

환원당은 DNS법을 이용하여 측정하였다. 원심분리(4000 rpm, 20분)한 술덧을 여과하여 1mL를 취한 후 DNS (dinitrosalicylic acid) 용액을 3mL 첨가하고 70°C에 7분간 반응시킨 다음 차가운 물에 담가 반응을 정지시켜준다. 증 류수 16mL를 첨가하여 섞어준 후 분광광도계(Genesys 10 UV, Thermo Spectronic, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡 광도를 측정하였다. 환원당 분석결과는 표준 포도당 용액 을 이용하여 검량선을 작성하여 계산하였다.

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법에 따라 시료 0.4mL 에 2% sodium carbonate 용액 4mL를 가하여 3분 동안 반응시킨 후, 2 N Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 0.2 mL 를 가하여 30분간 암소에서 반응시킨 후 분광광도계를 이 용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함 량은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준 검량 곡선을 통 해 계산하였고, 시료 중의 mg gallic acid equivalent (GAE)로 작성하였다.

총 플라보노이드 함량은 시료 1mL에 diethylene glycol 10mL, 1 N NaOH 1mL를 첨가하여 혼합한 후, 37°C 항 온수조에서 1시간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준검량곡선은 quercetin 을 사용하였고 시료 중의 mg quercetin equivalent로 작성 하였다.

DPPH에 의한 전자공여능(EDA, electron donating ability) 은 Blois (1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 1mL에 증류수 3mL와 0.2mM DPPH 4mL를 가하여 10 초간 섞은 다음 30분 동안 방치한 후 분광광도계를 사용 하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 대신 시료추 출용매로 공시험도 함께 진행하였다. DPPH에 의한 전자공 여능은 아래 식을 이용하여 백분율(%)로 나타내었다. 비교 군은 ascorbic acid (0.06 mg/mL)를 사용하였다.

아질산염 소거능은 Gray & Dugan (1975)의 방법으로 측정하였다. 시료 1mL에 1mM NaNO₂ 2mL를 첨가한 뒤 0.1 N HCl 용액과 0.2M 구연산 완충용액을 첨가하여 각각 pH 1.2, 3.0과 6.0으로 조절하여 1시간 동안 37°C에 서 반응시켰다. 각 반응액 1mL를 취하여 2% acetic acid 용액 5mL와 Griess 시약 0.4mL를 첨가하여 잘 혼합한 후 15분간 실온에서 반응시킨 후 분광광도계를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 Griess 시약 대신 증류수 0.4mL를 가하여 동일하게 진행하였다. 아질 산염 소거능은 아래 식을 이용하여 백분율로 나타내었다. 비교군은 ascorbic acid (2 mg/mL)를 이용하였다.

사용한 균주는 Lactobacillus plantarum, Escherichia coli C3000, Staphylococcus aureus ATCC 25923로 3회 계대배 양하여 활성화시킨 후 L. plantarum은 액체배지 10mL에 1백금이를 접종하고, E. coli와 S. aureus는 액체배지 100 mL에 1 plate 접종하여 37°C에서 16-24시간 배양하였다. L. plantarum은 Lactobacilli MRS agar (Difco)배지 10mL 당 seed의 O.D 값이 1로 희석된 균액 0.1mL을 넣어 항균 활성 분석용 평판을 제조하였고 E. coli 및 S. aureus는 nutrient agar (Difico) 배지 10mL당 seed의 O.D 값이 1로 희 석된 균액 0.1mL을 넣어 항균활성분석용 평판을 제조하였 다. 대조물질은 ampicillin을 10 ppm으로 희석하여 사용하였 으며 시료는 13,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 상등액을 취해 L. plantarum은 원액, E. coli 및 S. aureus는 1/2 희석 액으로 희석하여 항균활성 분석 시료로 사용하였다. 항균활 성 분석용 평판 위 iron cylinder를 올린 후에 안에 150 mL 씩 대조물질 및 시료를 피펫을 통해 주입하였다. 1시간 동 안 diffusion되게 유지한 후 30°C에서 24시간 배양하였다. 항 균활성정도는 clear zone의 유무와 지름으로 구분하였다.

3회 반복 측정한 실험결과 값은 평균±표준편차로 표시하 였고 SPSS (IBM SPSS Statistics 21)프로그램을 이용하여 Duncan’s multiple range test를 실시하여 p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.

입국과 누룩을 발효제로 사용하고 매실 농축액의 첨가량 에 따른 막걸리 술덧의 이화학적 특성 변화는 각각 Fig. 1 과 Fig. 2에 나타내었다. 효모가 당 성분을 분해시키는 과 정에서 알코올이 생성되어 알코올 함량이 증가하게 된다 (Choi et al., 2013). 알코올 함량변화는 입국의 경우 1일차 에 매실 무첨가구(0%)가 7.9%였고 매실 함량이 증가함에 따라 낮은 값을 보였다. 발효 3일 차에 0%가 13.95%, 나 머지첨가군들이 12.75-13.35%의 값을 보여 모든 실험군에 서 알코올함량의 급격한 증가를 보였다. 이후 서서히 증가 하여 발효 종료 시점인 15일에는 0%가 18.9%로 가장 높 았으며 나머지 매실 첨가군들은 18-18.6%로 낮은 값을 보 였다(Fig. 1a). 매실의 산 성분으로 인해 효모의 생육 저해 가 발생하는 것으로(Jeong et al., 2010) 보여지는데 매실 첨가량이 크지 않아 최종 알코올 함량에는 유의적인 차이 는 보이지 않았다. 누룩의 경우 1일차에 모든 실험군의 알 코올 함량이 11%를 넘어서며 급격한 증가를 보였고 3일차 에 17%를 넘어 서서히 증가하여 발효 종료 시점인 7일차 에는 18.4%까지 증가하였다(Fig. 2a). 누룩의 경우 매실의 첨가에 따른 알코올 함량의 변화 차이는 입국에 비해 작았 다. 결과적으로 입국과 누룩 모두 매실의 첨가가 알코올 생성에는 크게 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 환원 당은 입국의 경우 발효 초기 1일 차에 0%가 6.59 mg/mL 로 매실첨가군들의 값 4.63-6.12 mg/mL에 비해 높은 값을 보였다(Fig. 1b). 발효 3일 차에 모든 실험군들에서 이전 값에 비해 대폭 감소하여 1.36-2.42 mg/mL의 값들을 보였 으나 매실 첨가에 의한 차이는 적었다. 이후 11일까지 일 정한 값을 유지하다 이후 증가하는 경향을 보였다. 누룩의 경우 입국에 비해 높은 값을 보였는데 발효 1일차에는 0% 가 38.42 mg/mL로 매실첨가군들(16.6-19.08 mg/mL)에 비 해 큰 값을 보였고 매실의 첨가에 따라 약간 감소하는 경 향을 보였다(Fig. 2b). 발효 3-5일 차에 걸쳐 모든 실험군 에서 급격한 감소를 보였다가 이후 증가하는 경향을 보였 는데 매실의 첨가에 따라 환원당의 함량은 감소하는 경향 을 보였다. 입국과 누룩 사용시 모두 환원당은 알코올 생 성에 관여되어 알코올 생성이 원활할 때 환원당은 감소하 며 알코올 생성이 원활하지 않을 때 환원당이 증가하는 경 향을 보여 이는 효모가 환원당을 이용하여 알코올 발효를 진행하다가 일정 수준의 알코올 농도에서 효모가 발효를 진행하지 못하게 되어 나타나는 결과로 생각된다. 산도는 입국과 누룩 모두 발효 진행동안 유사한 값을 나타내었고 입국의 산도가 누룩의 산도보다 유의적으로 높은 값을 보 였다(Fig. 1c, Fig. 2c). 입국의 경우 발효 종료 시 0%가 0.32, 1%가 0.37, 3%가 0.49, 5%가 0.61의 값을 보였고 누룩의 경우 발효 종료 시 0%가 0.18, 1%가 0.25, 3%가 0.37, 5%가 0.51의 값을 보여 매실 첨가량이 증가함에 따 라 총 산도값이 유의적으로 증가하는 경향을 보였다. 이와 같은 결과는 매실에 함유된 유기산에 기인함으로 생각된다. pH 값은 입국과 누룩 모두 발효가 진행됨에 따라 대체로 증가하는 경향을 보였는데 매실 첨가량이 증가할수록 낮은 값을 나타내었다(Fig. 1d, Fig 2d). 다만 입국에 비해 누룩 의 경우 매실 첨가량에 따른 pH 감소가 두드러지게 나타 났다. 결과적으로 매실의 첨가가 막걸리의 정상적인 발효 에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며 발효 종료 시점을 알코올 함량이 더 이상 증가하지 않고 알코올 발효 에 필요한 환원당 사용이 감소하여 환원당 함량이 증가할 때로 결정하였는데, 입국의 경우 15일, 누룩의 경우 7일로 나타나 누룩을 사용할 경우 담금 기간이 단축될 수 있음을 알 수 있었다.

Fig. 1. Changes in (a) alcohol contents, (b) reducing sugar, (c) total acidity, (d) pH of Makgeolli containing Prunus mume extract using Ipguk. ◆: 0%, ■: 1%, ▲: 3%, ●: 5%.

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Fig. 2. Changes in (a) alcohol contents, (b) reducing sugar, (c) total acidity, (d) pH of Makgeolli containing Prunus mume extract using Nuruk. ◆: 0%, ■: 1%, ▲: 3%, ●: 5%.

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입국과 누룩을 사용한 막걸리의 매실 첨가량에 따른 총 페놀함량과 총 플라보노이드 함량의 변화를 측정한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 입국을 발효제로 사용한 막걸리의 경 우 총 페놀 함량은 매실 무첨가구(0%)의 경우 3.66mg/mL 로 나타났고 매실의 첨가량이 1%와 3%일 경우 각각 3.67 과 3.70 mg/mL로 무첨가구에 비해 유의적인 증가는 보이 지 않았으나 매실 첨가량이 5%일 때 3.82mg/mL로 유의 적으로 증가하였으며 증가폭은 그리 크지 않았다. 누룩의 경우 모든 실험군에서 입국에 비해 낮은 총 페놀 함량을 보였으나 매실 첨가량이 증가함에 따라 2.93, 2.98, 3.11 mg/mL의 값을 보여 2.87mg/mL의 무첨가구에 비해 증가 하는 경향을 보였다(Fig. 3a). 이와 같은 결과는 입국을 발 효제로 사용하였을 때 발효과정에서 누룩보다 많은 페놀성 화합물이 생성되고 막걸리 자체 내에 페놀성 화합물이 존 재하여 매실 첨가로 인한 증가는 그리 크지 않은 것으로 생각된다. 총 플라보노이드 함량의 변화도 총 페놀 함량의 변화와 비슷한 양상을 보였는데 입국의 경우 매실 첨가량 이 증가함에 따라 0.285, 0.285, 0.361, 0.481 mg/mL로 증 가하였고 누룩의 경우도 입국과 마찬가지로 매실 첨가량에 따라 0.074, 0.074, 0.079, 0.085 mg/mL로 증가하였다. 입 국을 사용하여 제조한 막걸리가 누룩을 사용한 막걸리보다 총 플라보노이드 함량이 유의적으로 높은 값을 보였다(Fig. 3b). 매실 첨가에 의한 총 페놀과 총 플라보노이드 함량의 유의적인 증가는 적어도 3% 이상 매실을 첨가하였을 때 나타남을 확인할 수 있었다.

Fig. 3. Total phenol (a) and total flavonoid contents (b) of Makgeolli containing Prunus mume extract using Ipguk (black) and Nuruk (grey).

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입국과 누룩을 발효제로 사용한 막걸리의 매실 첨가량에 따른 DPPH에 의한 전자공여능 분석결과는 Fig. 4에 나타 내었다. 입국을 발효제로 사용한 경우 매실함량이 증가함 에 따라 56.98, 63.18, 78.06, 81.58%로 순차적인 증가가 유의적으로 측정되었다. 비교군으로 사용한 ascorbic acid의 효과는 82.29%로 모든 매실첨가군은 이보다 낮은 값을 보 였다. 누룩을 발효제로 사용한 막걸리의 경우 매실 첨가량 이 증가함에 따라 59.65, 81.64, 82.78, 82.36%의 값을 보 여 매실 첨가로 인해 유의적인 증가를 보였으나 매실 첨가 량의 증가에 따른 유의적인 차이는 없었다. 비교군으로 사 용한 ascorbic acid의 효과는 73.78%로 입국에서의 비교군 보다 낮은 값을 보였고 매실첨가군에서의 활성이 ascorbic acid 보다 약 8% 높은 효과를 보였다. 페놀성 화합물들의 hydroxyl group은 DPPH와 반응하기 쉬운 입체구조를 가지 고 있어 페놀성 물질의 증가는 DPPH radical 소거능의 증 가를 보이는데 (Lee et al., 2012;Kim et al., 2012) 발효 시 생성된 알코올에 의해 추출된 매실의 페놀성 물질에 기 인한다고 생각된다.

Fig. 4. DPPH free radical scavenging activity of Makgeolli containing Prunus mume extract using Ipguk (black) and Nuruk (grey).

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입국과 누룩을 발효제로 사용한 막걸리의 매실 첨가량에 따른 아질산염 소거능은 Fig. 5에 나타내었다. 입국의 경우 pH 1.2에서 매실 첨가량이 증가함에 따라 71.25, 69.46, 67.63, 71.47% 값을 보여 유의적인 증감은 보이지 않았으 나 pH 3과 pH 6에서는 매실 첨가에 따른 증가를 보였는 데 pH 6에서 매실 첨가로 인한 증가가 확실하게 나타났다. 비교군인 ascorbic acid의 아질산염 소거능은 pH 1.2 일 때 98.9%, pH 3 일 때 65.4%, pH 6 일 때 21.2%로 나타 났다. 누룩의 경우 pH 1.2에서 매실 첨가량이 증가함에 66.62, 67.59, 67.46, 68.29%로 유의적인 증가는 보이지 않 았다. pH 3과 pH 6에서는 매실 첨가량에 따른 유의적인 증가를 나타냈다. 비교군인 ascorbic acid의 아질산염 소거 능은 pH 1.2 일 때 98.16%, pH 3 일 때 84.0%, pH 6일 때 12.6%로 나타났다. 모든 실험군에서 pH 1.2에서 pH 6 으로 증가함에 따라 아질산염 소거능이 낮아지는 결과를 나타내었다.

Fig. 5. Nitrite scavenging activity of Makgeolli containing Prunus mume extract using Ipguk (a) and Nuruk (b).

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입국과 누룩을 사용하여 제조한 막걸리의 매실 첨가에 따른 항균활성 효과는 Tab le 1에 나타내었다. L. plantarum 는 막걸리에 존재하는 유산균의 일종으로 프로바이오틱스 로서 건강 기능성을 가지는 것으로 알려져 있다(Nguyen et al., 2007). L. plantarum에서는 입국과 누룩을 발효제로 사 용하였을 때 모든 실험군에서 뚜렷한 clear zone이 관찰되 지 않아 매실 첨가로 인한 L. plantarum에 대한 항균활성 이 나타나지 않았다. E. coli에서는 누룩을 사용하였을 경 우 뚜렷한 clear zone이 관찰되지 않았으나 입국을 사용하 였을 경우 매실 1% 첨가구에서 1.1 cm, 3% 첨가구에서 1.15 cm, 5% 첨가구에서 1.5 cm의 clear zone이 관찰되어 매실 첨가량이 증가할수록 E. coli에 대한 항균효과가 증가 함을 알 수 있었다. S. aureus에서도 누룩을 사용하였을 경 우 뚜렷한 clear zone이 관찰되지 않았으나 입국을 사용하 였을 경우 매실 3% 첨가구에서 0.9 cm, 5% 첨가구에서 1 cm의 clear zone이 관찰되어 매실 첨가량이 3% 이상일 경우 S. aureus에 대한 항균효과가 나타남을 알 수 있었다. 특히, 입국을 발효제로 사용한 경우 매실 5% 첨가구에서 E. coli에 대해 ampicillin과 같은 항균효과를 보이는 것으 로 나타났다. 매실의 첨가는 입국 사용 시 S. aureus보다 E. coli에 대한 항균효과가 높았는데 이는 매실 착즙액의 식중독 유발균에 대한 항균작용(Lee et al., 2003)과 같은 결과였다. 결과적으로 매실의 첨가는 막걸리 내 유산균인 L. plantarum의 증식에는 영향을 미치지 않는 반면, 식중독 유발균으로 그람 음성균인 E. coli균과 그람 양성균인 S. aureus균에 대한 항균효과가 비교적 큰 것으로 확인되었다. 또한, 발효제로 사용된 입국과 누룩을 비교하였을 때, 대체 적으로 입국에서의 뚜렷한 clear zone이 관찰되는 것을 보 아 입국을 이용하여 제조한 막걸리가 누룩을 이용해 제조 한 막걸리보다 매실 첨가에 의한 항균효과가 큰 것으로 확 인되었다. 이상의 본 연구결과는 매실추출물을 첨가하여 제조한 막걸리는 식중독 균의 생육을 억제하는 효과가 있 는 것으로 판단된다.

Table 1. Antimicrobial activities of Makgeolli containing Prunus mume extract using Ipguk and Nuruk

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