강황 발효를 위한 최적 배양 조건 탐색과 김치 유래 발효균주 선발

전라남도(곡성, 여수)에서 2019년에 생산된 갓김치, 배추 김치, 총각김치, 열무김치, 파김치를 구입하였다. 시료 1 g 에 멸균 3차증류수 225 g을 가하여 혼합한 후 균질기 (BagMixer 400CC, Interscience, France)를 이용하여 균질 화하였다. 이후 혼합액을 멸균 3차증류수로 단계희석하여 0.2% (w/v) CaCO₃ (Daejung Chemicals & Metals Co., Siheung, Korea)가 포함된 MRS (BD, Sparks, MD, USA) 한천배지에 도말하였다. 도말한 배지는 30°C에서 24-48시 간 동안 BD Gaspak^TM EZ Anaerobe Container System (BD)을 사용하여 혐기적 조건 하에 배양한 후, 투명한 환 (clear zone)을 형성하는 균주들을 1차 선별하였고, 형태학 적 차이가 나는 여러 집락을 2차 선발하였다. 분리 균주들 은 MRS 한천배지를 사용하여 30°C에서 혐기적 조건하에 배양하였다(Choi & Kim, 2017).

2017년 10-12월 사이에 수확한 강황을 사용하여 세척, 절단한 후 슬라이스 형태로 건조된 것을 ㈜비봉허브 (Yangju, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 믹서(HMF- 1600PB, Hanil Electronic., Seoul, Korea)로 90초간 분말화 한 뒤 300 μm 체(Chung Gye Sieve Co., Seoul, Korea)에 통과시킨 분말을 상온에서 밀봉 보관하며 시료로 사용하였 다(Ko & Jeong, 2017).

강황 발효를 위한 균주의 배양을 위해 질소원으로 yeast extract (BD; Y)를 0.5, 1, 2.5, 5% (w/v), 탄소원으로 maltodextrin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; M)은 1, 2.5, 5, 7.5, 10% (w/v)로 최종 농도가 되도록 배합(YM 배지)하고 1mL씩 24 well cell culture plate (SPL, Pocheon, Korea)에 분주하였다. MRS Broth에 30°C에서 12시간 배양한 김치분리균주 배양액 1% (v/v)를 배지에 접 종하고, 30°C에서 450 rpm으로 7일간 진탕배양하였다. 배 양 중 0일, 2일, 5일, 7일차에 sample을 회수하여 MRS 한 천배지에 도말하였고, 30°C에서 24시간 배양 후 생균수를 확인하였다.

YM 배지에 강황(turmeric powder, T)을 첨가한 배지 (YMT 배지)를 김치분리균주로 발효하기 전, YM배지에서 균주의 생존율을 확인하였다. 이를 위해 24 well cell culture plate (SPL)에 분주된 최적 YM 배지 1 mL에 MRS broth (BD)에 배양된 김치분리균주 배양액 1% (v/v)를 접 종하여 30°C에서 450 rpm으로 5일간 진탕배양하며, 0일, 2 일, 5일차에 생균수를 확인하였다. 일별로 수집한 배양액은 연속 희석하여 MRS 고체배지에 도말하였으며, 30°C에서 24시간 배양하고 형성된 집락을 계수하였다.

강황 발효를 위한 균주의 배양을 위해 최적화 된 발효용 YMT 배지를 250 mL 삼각플라스크에 넣고 121°C, 15분간 멸균 후 사용하였다. Lactococcus lactis KCTC 2013 균주 를 발효 대조구로 사용하였고, YM 배지에서 높은 생존율 을 보인 분리균주 8종을 MRS Broth에 접종한 뒤 30°C에 서 12시간 배양한 배양액을 최적화된 YMT 배지에 1% (w/v) 접종하여 30°C에서 450 rpm으로 7일간 진탕배양하였 다. 발효 0일, 2일, 5일, 7일차에 발효액을 회수하였고, 일 별로 수집한 배양액은 단계희석하여 MRS 한천배지에 도 말 후 30°C에서 24시간 배양하고 형성된 집락을 계수하여 CFU/mL로 환산하였다.

추출 방법은 Jung 등의 방법(Jung et al., 2012)을 실험에 맞게 변형하여 사용하였다. 강황 발효액은 발효 0일, 2일, 5일, 7일차마다 1 mL씩 회수하고, 95% ethanol을 5.3 mL씩 가하여 발효액 추출 용매 농도가 80% ethanol (v/v)이 되도 록 하였으며, sonicator (8510R-DTH, Branson, Danbury, CT, USA)로 상온에서 2시간동안 추출하였다. 추출물을 4°C에서 3,134 g로 10분간 원심분리(LABOGENE 1580R, Seoul, Korea)하였다. 이후 centrifugal evaporator (CVE- 3000, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 상등액을 40°C 에서 감압 농축 후, 동결건조(Alpha 1-4, CHRIST, Osterode am Harz, Germany)한 후, -20°C에서 냉동 보관 하며 시료로 사용하였다.

ABTS radical scavenging activity의 경우 1.0 mM AAPH (2,2'-azobis-(2-amidinopropane)HCl) (Sigma-Aldrich)와 2.5 mM ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) (Sigma-Aldrich)를 PBS와 혼합하 여 70°C에서 반응시킨 후 syringe filter (PTFE, 0.2 μm, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan)로 여과한 후 ABTS·-시약과 시료를 10분 동안 반응시켰다. 반응온도는 37°C이었으며, 흡광도는 96 well microplate reader (iMark, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 750 nm에서 3회 반복 측정하였다. 실험방법은 Re 등의 방 법(Re et al., 1999)을 변형하여 실험하였다.

Maltodextrin은 젖산균의 생장에 이용되는 maltose을 생 산하며, Shin의 연구(2002)에서는 김치에서부터 분리한 Lactobacillus brevis의 maltose별 성장곡선을 확인하였을 때, maltose를 2% 첨가 시 젖산균의 생균수가 가장 높았 다고 하였다. Maltodextrin은 젖산균의 생장에 영향을 미치 는 주요 탄소원이며, 젖산균을 동결건조 시 저장안정성을 높이는 방법으로 가장 많이 쓰이는 성분이다(Semyonov et al., 2010). Yeast extract는 젖산균 배양 시 질소원으로 가 장 일반적으로 많이 사용하며, Lactobacillus sp. 계열의 경우 젖산을 생산하는 가장 좋은 질소원으로 알려져 있다 (Cho et al., 1995;Shin 2002;Reddy et al., 2009). 젖산 균 발효를 위한 최적 배지를 제조하기 위해 탄소원인 maltodextrin과 질소원인 yeast extract의 비율을 조정하여 김치에서 분리된 균주 1종(YRK #2-3)을 접종 후, 7일간 배양하며 생균수를 확인하였다. Table 1의 결과를 볼 때, 모든 조건에서 발효일수가 증가할수록 더 높은 생균수를 보였고, 같은 maltodextrin 농도에서는 yeast extract의 양이 증가할수록 높은 생균수를 보였으며, maltodextrin의 농도 와는 상관없이 yeast extract 최고 농도인 5% 농도에서 5 일차 또는 7일차에서 가장 높은 생균수를 보였다. 그 중 1% (w/v) maltodextrin, 5% (w/v) yeast extract 농도에서 5 일차 생균수가 0일차 보다 약 2 log이상 증가하는 경향을 보였다. 따라서 김치 분리균주의 생균수에 따른 YM배지의 최적 비율은 1:5, 농도는 1% (w/v) maltodextrin, 5% (w/v) yeast extract로 최적화 하였다.

강황발효배지에 적용하기 전 최적 YM 배지에서 분리균 주 30종에 대한 생균수를 확인하였다. 각각의 균주를 접종 한 발효강황은 30°C에서 진탕배양했으며, 발효일수별로 발 효액을 회수하여 MRS 한천배지에서 생균수를 측정하였다 (Table 2). 그 결과, GOT SY #1 1-2, GOT SY #5 1-2, CGK KT #3 2-1, CGK KT #5 1-9, YRK KT #3 1-2, YRK KT #3 1-3, CCK KT #3 1-2, CCK KT #5 1-2 등 분리균주 8종은 발효 5일차에서 4.0×10⁶ - 2.1×10⁸ CFU/mL 의 높은 생균수를 보였고, 나머지 22개의 발효군은 5일차 에 그 이하의 생존율을 보이거나 사멸하였다. 발효 대조구 로 사용한 L. lactis KCTC 2013 균주도 5일차에는 생균수 가 낮게 나타났다. 따라서 YM 배지에서 높은 생균수를 보 인 분리균주 8종을 선발하여 YMT 배지에 적용하였다.

발효 대조구인 L. lactis KCTC 2013과 선발된 김치에서 분리된 균주 8종을 YMT 배지에서 7일간 배양하며 발효일 수 별 발효강황의 생균수를 확인하였다(Table 3). 발효 0일 차에는 생균수가 1.0×10⁶ - 2.3×10⁷ CFU/mL으로 강황 균주 간에 큰 차이를 보이지 않았고, 발효 2일차에 균수가 감소 하였던 분리균주 GOT SY #1 1-2, CGK KT #3 2-1, CGK KT #5 1-9, YRK KT #3 1-2, YRK KT #3 1-3, CCK KT 3# 1-2 균주들은 발효 5일차에 균수가 0.15-1.92 log CFU/mL 만큼 다시 증가한 것을 확인할 수 있었다. 발 효 7일차에는 생균수가 8.2×10⁴ - 3.0×10⁶ CFU/mL으로, GOT SY #5 1-2 균주를 제외한 7종의 발효군에서 상대적 으로 높은 생균수를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

ABTS radical scavenging capacity를 확인한 결과, 접종 하지 않은 YMT 배지는 발효기간동안 4.31±0.10 - 4.83±0.03 mg VCE/mL로 낮은 항산화능을 보였으며, 발효기간 7일 동안 항산화능이 점차 감소하는 경향을 보였다. 대조구인 L. lactis KCTC 2013를 접종한 발효강황의 경우 4.69±0.11 - 5.41±0.16 mg VCE/mL 범위의 항산화능을 보였다(Table 4). 김치에서 분리한 8균주로 발효된 강황의 항산화능은 4.81±0.19-6.31±0.32 VCE/mL이었다. 분리균주의 경우, CGK KT #3 2-1, CGK KT #5 1-9 균주로 발효한 강황은 발효 0일차에 항산화능이 가장 높았으나, 2일차에서 항산화능이 낮아지다가 그 이후 7일차까지 유지하는 경향을 보여 발효 에 의한 항산화능의 증가는 보이지 않았다. 따라서, 발효 0일차에 가장 높은 활성을 보였던 CGK KT #3 2-1, CGK KT #5 1-9를 접종한 발효군은 제외하였다. 반면에 CGK KT #3 2-1, CGK KT #5 1-9 제외한 6종의 분리균주 발 효군(GOT SY #1 1-2, GOT SY #5 1-2, YRK KT #3 1- 2, YRK KT #3 1-3, CCK KT #3 1-2, CCK KT #5 1-2) 에서는 발효가 진행될수록 항산화능이 발효 0일차보다 높 아졌다. 그 중, GOT SY #1 1-2, YRK KT #3 1-2, YRK KT #3 1-3, CCK KT #5 1-2를 접종한 발효강황군은 2일 차에서 각각 5.79±0.16 mg VCE/mL, 5.48±0.06, 5.55±0.21 mg VCE/mL, 5.81±0.04 mg VCE/mL로 가장 높은 항산화 능을 보였고, CCK KT #3 1-2은 5일차에서 5.64±0.21 mg VCE/mL로 가장 높은 항산화능을 보였다. 이를 통해 가장 높은 항산화능을 보인 발효일수는 균주마다 다른 것을 확 인할 수 있었다. 최적 배양 일수는 젖산균주의 특성에 따 라 차이가 날 수 있다는 연구(Kim et al., 2012;Lee & Hong, 2015)와 동일한 경향을 보였다. 배추김치에서 분리 한 Lactobacillus plantarum 균주로 천궁을 발효하여 ABTS 라디칼 소거능과 DPPH 라디칼 소거능을 확인한 연구 (Jeong et al., 2019)에서는 비발효군에서 보다 발효군에서 높은 소거능 활성을 보였으며, ABTS 라디칼 소거능보다 DPPH 라디칼 소거능이 더 높은 활성을 보였다. 본 연구에 서는 Jeong 등(2019)과는 다르게 DPPH 라디칼 소거능 보 다 ABTS 라디칼 소거능이 더 높은 활성을 보였는데(data not shown), 이는 발효 시 발효일수, 발효원료, 균종 등에 따라 생리활성물질 조성이 달라질 수 있기 때문으로 생각 된다. 발효강황의 항산화능은 균주에 의해 강황이 발효되 면서 강황 자체에는 없거나 미량이었던 유효성분이 발효에 의한 생물전환에 의해 증가했을 것으로 생각되며(Wu et al., 2016), 이를 통해 새로운 기능성을 확인할 수 있을 것 으로 기대된다.

총 8종의 균주에서 발효과정 중 7일차에 생균수가 크게 낮아진 GOT SY #5 1-2와 발효를 통해 항산화능이 증가 하지 않은 2종(CGK KT #3 2-1, CGK KT #5 1-9)을 제 외한 GOT SY #1 1-2, YRK KT #3 1-2, YRK KT #3 1- 3, CCK KT #3 1-2, CCK KT #5 1-2 등 김치분리균주 5 종을 강황 발효를 위한 균주로 최종 선발하였다. 본 연구 를 통해 강황을 발효할 때 생존력이 높고 항산화능을 향상 시킬 수 있는 발효 최적 균주를 김치로부터 분리하였고, 이를 추후 강황발효에 적용하고자 한다.