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서 론
콩(Glycine max, L)은 우리나라의 중요한 식량자원으로 오랫동안 콩나물, 두부, 비지, 두유 및 장류 등 다양한 용 도로 식생활에 애용되어 왔다(Ha et al., 2013). 특히 콩은 장류의 맛과 향 등 품질을 결정짓는 중요한 원료소재이며, 영양적 측면에서 질병예방 및 치료분야까지 소비시장이 다 양해지면서 소비자들의 관심이 더 높아지고 있다(Yang & Kim, 2013;Jung et al., 2016). 이에 따라 산업체에서는 고품질화, 제품다양화, 안전성 및 간편성 등 소비자 니즈 를 고려한 장류 제품개발이 시도되고 있으며 육종 부서에 서도 가공 용도별 품종을 개발하려는 연구가 지속적으로 이루어지고 있다(Kim et al., 2017). 콩을 이용한 발효는 미생물이 효소에 의해 섬유질과 세포내 당류 및 단백질 등 으로 분해되면서 체내 소화율을 높이고(Lee et al., 2005;Zheng et al., 2011), 생성된 유용 기능성 물질(isoflavone, polypeptide, polyglutamate, amide, peptone 등)은 항암, 항 산화, 면역력 강화, 혈압강화 및 혈전용해능 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Cho et al., 2000; Lee et al., 2001;Kim et al., 2002;Zheng et al., 2011).
우리나라에서 콩 발효제품은 주로 장류로 발효제에 쓰이 는 메주에 따라 품질에 영향을 미치게 되는데, 특히 전통 방법으로 제조할 경우 콩의 종류, 제조방법, 제조시기 및 지역 등에 따라 다르고 잡균 혼입으로 품질이 균일하지 못 한 문제점이 발생한다. 이를 해결하기 위하여 발효에 관여 하는 미생물(B. subtilis, A. oryzae 등)을 분리 및 동정하여 인위적으로 균을 접종하여 이용하는 방법에 대한 연구가 시도되고 있다(Lin et al., 2006;Chang & Chang 2007;Lee et al., 2016a). 기 보고된 콩 발효에 관한 연구는 생리 활성에 관한 연구(Yang & Kim, 2013;Sasithorn, 2017;Fabricio et al., 2018;Cao et al., 2019)가 주로 보고되었고, A. oryzae와 단백질 분해효소를 이용한 메주특성 연구(Gil et al., 2017), 개량메주와 청국장의 품질개선 및 품질특성 연구(Park et al., 1990;Lin et al., 2006;Lee et al., 2016b), 맛과 향미에 관한 연구(Shon et al., 2002;Park et al., 2017), 발효미생물의 특성 연구(Lee et al., 2014) 등 다양한 연구가 보고되었지만, 아직 콩 품종별 장류 및 콩 발효물 제조에 적합한 균주에 대한 발효특성을 비교한 연 구는 미미한 실정이다.
본 연구에서는 전통장류 유래 Aspergillus spp. 이용 콩 발효물을 제조하여 발효특성 비교를 통해 우수한 콩 품종 선발을 위한 기초자료로 제시하고자 곰팡이 이용 콩 발효 물의 외관 및 품질, 효소활성도, 색도, 아미노산 등의 품질 특성을 비교하였다.
재료 및 방법
콩은 2017년 경상남도 밀양소재 국립식량과학원에서 재배 및 수확한 것으로 대원콩(Daewonkong), 태광콩 (Taekwangkong), 우람(Uram), 대찬(Daechan), 대풍-2호 (Daepung-2), 선풍(Seonpung) 등 6가지 품종을 실험에 사 용하였다. 콩 품종별 곰팡이 이용 발효물은 Lee et al., (2014) 방법을 참고로 하여 제조하였다. 즉, 콩을 각각 수 세하여 상온(22±2°C)에서 15시간 동안 수침한 후 30분 물 빼기를 하여 수분을 제거하였다. 이후 고압증기멸균기(BF- 60AC autoclave, Biofree Co. Ltd., Seoul, Korea)를 이용하 여 121°C에서 30분 동안 증자(멸균)하였다. 증자된 콩은 무균상태에서 40°C 이하로 식힌 다음 배양된 균주를 각각 1% (v/w)씩 접종하여 혼합하였다. 배양된 균주는 전통장류 에서 유래된 A. oryzae PS03으로 PDA (Difco, Detroit, MI, USA)배지에 접종하여 25°C에서 7일간 배양하여 얻은 균 을 포자수 1×107 spore/g로 희석하여 사용하였다. 곰팡이 균이 접종된 콩을 스티로폼 상자(21×27×14 cm)에 담아 발 효실(온도 25°C, 습도 70%)에서 24시간 숙성시켜 곰팡이 이용 콩 발효물을 제조하였다. 콩 발효물의 발효특성을 측 정하기 위한 추출물 제조는 시료 일정량을 증류수에 넣고 homogenizer (HG-15A, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea)로 균질화한 다음 진탕배양기(WiseCube WIS-RL010, Daihan Scientific Co., Ltd.)에서 추출(150 rpm, 1 hr)하여 원심분리(10,000 rpm, 10 min)한 후 상등액을 추출물로 하 였다.
품종별 원료콩의 일반성분 특성으로 지방, 단백질 회분은 AOAC 방법으로 측정하였다. 조지방은 Soxhlet (SoxtecTM 2050 Analyzer Unit, Foss Tecator, Hoganas, Sweden)를 이 용하여 diethyl ether로 추출한 다음 정량하였으며, 조단백 질은 Micro-Kjeldahl법을 참고로 분해기(Tecator Digestor auto, Foss Tecator, Laurel, MD, USA)와 자동 단백질분석 기(2300 Kjeltec Analyzer Unit, Foss Tecator)로 분석하였 다. 조회분 함량은 600°C에서 5시간 동안 직접회화법으로 전기회화로((DS-84E, Dasol Scientific Co., Ltd, Hwaseong, Korea)를 이용하여 분석하였다.
품종별 곰팡이 이용 콩 발효물의 품질특성으로 pH와 TA (titratable acidity), 아미노태질소 함량 및 곰팡이수를 측 정하였다. pH 측정은 pH meter (Metrohm 691, Metrohm, Herisau, Switzerland)를 이용하여 측정하였으며, TA는 시료 10 mL를 취한 다음 0.1 N NaOH (F = 1.000) 용액을 넣어 잘 혼합한 후 pH가 8.3이 될 때까지 소비된 NaOH의 mL 를 측정하여 젖산함량(%, w/w)으로 나타내었다. 아미노태 질소(amino nitrogen, NH2-N) 함량은 KFDA (2008)와 Choi et al. (2007) 방법을 참고하여 formol 적정법으로 측정하였 다. 즉, 시료 추출액 5 mL에 중성용액 formalin 10 mL와 증 류수 10 mL을 넣고 잘 혼합한 다음 0.5% phenolphthalein 용액 2-3방울 첨가하였다. 여기에 0.1 N NaOH를 넣어 미 홍색이 될 때까지의 적정량을 측정하였으며, 공시험도 동 일한 방법으로 측정한 후 아미노태질소 함량을 계산하였 다. 곰팡이 수 측정은 PYM 건조필름을 이용하여 3M사의 사용설명서와 Kim et al. (2004)의 방법을 참조하여 측정 하였다. 먼저 시료를 멸균생리식염수(0.9% NaCl) 용액으로 10진 희석법에 의해 희석한 시료를 PYM 건조필름에 접종 한 후 배양기(25°C)에서 3일 동안 배양한 후 다양한 색상 과 가장자리 부분이 명확히 구분되지 않는 것을 곰팡이 균 으로 계수하여 log CFU/g으로 표시하였다.
곰팡이 이용 콩 발효물의 색도는 일정량의 시료를 취한 다음 색차계(CM-3500d, Minolta, Tokyo, Japan)를 이용하 여 Hunter’s color value인 L값(lightness), a값(redness) 및 b값(yellowness)을 측정하였다. 이때 사용한 표준백판의 L 값은 98.32, a값은 -0.01, b값은 0.03이었다.
품종별 곰팡이 이용 콩 발효물의 효소활성으로 α-amylase 와 protease를 측정하였다(Von 1993;Lee et al., 2014). α- Amylase 효소활성 측정은 0.02M phosphate buffer (pH 7.0)을 사용한 1% 가용성전분 용액 3 mL에 시료 추출액 1mL를 첨가하여 40°C에서 10분 동안 반응시킨 다음 1 M HCl 10 mL를 넣어 반응을 중지시켰다. 이중 1 mL를 취한 다음 요오드화 용액(0.005% I2＋ 0.05% KI)를 10 mL 넣어 발색시킨 후 분광광도계(T80+ UVNIS Spectrophotometer, PG Instruments, Alma Park, UK)를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 1M HCl 10 mL를 넣어 반응을 중지 시킨 후 시료 추출액을 넣어 반응 및 발색시 킨 다음 측정하였다. 측정된 값은 조효소액 1 mL가 1분 동안 전분 0.1 mg을 분해한 양을 1 unit으로 하여 계산하였 다. Protease 효소활성은 기질용액은 0.2M phosphate buffer에 0.6% casein을 용해한 다음 pH를 7.0으로 보정 하여 제조하였다. 제조된 5 mL 기질용액에 1 mL 시료 추 출물을 넣어 37°C에서 10분 동안 반응시킨 후 0.44 M TCA (trichloroacetic acid)용액 5 mL를 첨가하였다. 이를 실온에서 30분 동안 방치한 다음 여과(No.2, Whatman, Buckinghamshire, UK)한 후 여액 2 mL에 0.55M Na2CO3 용액 5 mL와 3배 희석된 Folin reagent 용액 1 mL를 넣어 실온에서 30분 동안 방치하였다. 이를 분광광도계(T80+ UVNIS Spectrophotometer)에서 흡광도(660 nm)를 측정하 였다. 표준물질은 tyrosine으로 하여 표준곡선을 작성하였 고, 1분 동안 tyrosine 1 μg을 생성하는 능력을 1 unit으로 나타내었다.
품종별 곰팡이 이용 발효물의 유리 아미노산 함량은 동 결건조 시료 0.2 g에 5 mL 에탄올을 첨가하여 1시간 동안 균질화 하였다. 이것을 원심분리(10,000 rpm, 10 min, Hanil; ULTRA 4.0, Seoul, South Korea)한 후 얻은 상등액을 감 압농축기(rotary evaporator, EYELA A-3S, RikakikaiCo., Ltd., Tokyo, Japan)로 감압 농축하였다. 이를 20 mL 0.02 N HCl에 녹여 10배 희석한 후 0.22 μm membrane filter (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)로 여과한 후 아미 노산 자동분석기(Hitachi, L-8900, Post-reaction type, Tokyo, Japan)에 주입하여 분석하였다(Lee et al., 2014).
결과 및 고찰
품종별 원료콩의 조지방, 조단백질 및 조회분을 조사한 결과 Table 1에서 보는 바와 같이 품종별로 유의적인 차 이를 나타내었다. 조지방 함량은 18.28-19.15% 범위로 평 균 18.77%를 나타내었다. 조단백질 함량은 대찬과 선풍 품종이 각각 38.72% 및 38.64%로 가장 높았고 태광콩이 36.49%로 가장 낮았다. 조회분은 4.34-5.01% 수준으로 콩 품종별로 차이를 보였다. Medic et al. (2014)과 Lee et al. (2018)은 콩의 단백질 함량은 40-41%라고 보고하였으나 본 연구의 6품종에 대한 단백질 함량과는 조금 낮은 수준 이었다. 또한, Chang et al. (1990)의 보고에 의하면 단백 질 함량이 높은 품종일수록 지방 함량이 낮아지는 경향이 었다고한 보고와 본 연구결과와 비슷한 경향을 보였다. 콩 품종별로 제조한 발효물의 외관을 살펴보면 품종별로 다른 양상을 보였지만 대부분의 발효물에서 곰팡이가 잘 형성되 었다(Fig. 1). 특히, 콩 발효물의 외관상 곰팡이의 색에 있 어 다양한 양상을 보였는데, 대원콩과 대찬이 비슷하게 황 록색 포자가 형성되었으며 우람은 황색, 태광과 선풍은 흰 색 곰팡이가 더 많은 것이 확인되었다. 이러한 곰팡이(A. oryzae) 이용 콩 발효물의 외관의 색 차이는 곰팡이의 활 성도가 발효정도에 따라 색의 변화를 주어 활성 초기에는 흰색으로 자라다가 점점 노란색에서 황록색으로 포자가 형 성되어 변화면서 활성 정도가 높아진다(Kim et al., 1998). 따라서 품종별 발효물의 활성도가 높은 콩 품종은 대찬임 을 알 수 있었다.
품종별 곰팡이 이용 콩 발효물의 품질특성으로 pH, TA, 아미노태질소 및 곰팡이수를 측정한 결과는 Table 2에서 보는 바와 같았다. pH는 6.31-6.60 수준으로 나타났으며, TA는 0.36-0.48으로 품종별 유의적인 차이를 보였다. 콩의 발효과정에서 pH와 TA는 콩 단백질이 아미노산으로 분해 되어 탈아미노화 되면서 암모니아 생성정도에 따라 달라지 므로 발효환경이 중요한 요소이다(Yoo et al., 1998). Cho et al. (2016)의 연구에서 메주의 pH와 TA는 주로 자라는 균주에 따라 달라진다고 보고하였다. 따라서 본 연구결과 를 고려할 때 콩 발효물의 pH와 TA가 다르게 나타난 것 은 콩 품종별 발효정도의 차이에 의한 것으로 사료된다. 품종별 곰팡이 이용 콩 발효물의 아미노태질소 함량은 Table 2에서 보듯이 시료에 따라 유의적인 차이를 보였다. 일반적으로 아미노태질소 함량은 발효정도를 판단하는 중 요한 품질지표로 사용되며, 발효물 제조 시 사용된 균주 의 protease로 인해 단백질이 아미노산으로 변하기 때문이 라고 알려져 있다(Park et al., 1994). 품종별 발효물 중 대찬이 791.12 mg%로 가장 높았으며 태광과 선풍이 각각 641.23 mg% 및 657.69 mg%로 가장 낮았다. 기 보고된 연 구결과에서 메주 제조 시 세균 및 곰팡이를 균주로 접종하 였을 때 곰팡이(A. oryzae)를 접종한 시료에서 발효 초기 아미노태질소 함량이 약 520.00 mg% 정도로 더 높았다고 보고한 것과 비교해보면 본 연구에서 모든 시료에서 조금 더 높은 수준을 나타내었다(Cho et al., 2016). 이러한 품 종별 곰팡이 이용 발효물의 시료에 따라 아미노태질소 함 량이 차이가 나는 것은 온도, 시간 등의 발효조건이나 원 료콩의 영양성분, 물리적 특성 등에 따라 나타나는 것이며, 발효과정에서 미생물의 종류 및 관여하는 효소작용 조건이 시료마다 각각 다르기 때문으로 여겨진다(Shin et al., 2019). 콩 발효물의 곰팡이수를 측정한 결과 품종에 따라 유의적인 차이를 나타내었다(Table 2). 품종별로 7.63-9.20 log CFU/g 범위의 수준으로 대찬 이 가장 많은 편으로 나 타났다. Yoo et al. (1998)은 재래식 메주의 곰팡이수는 6.00 log CFU/g이었다고 한 보고와 Cho et al. (2016)의 연구에서 5.00 log CFU/g이었다는 결과보다는 본 실험에 서는 많은 편이었다.
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품종별 곰팡이 이용 색도를 측정한 결과 Table 3에서 보 듯이 명도인 L값의 경우 선풍이 71.28으로 가장 높았고 대원과 대찬이 각각 59.52 및 63.17으로 가장 낮았다. 적 색도를 나타내는 a값은 0.11-3.03 범위로 대원콩이 가장 높 았으며, 황색도를 나타내는 b값은 14.61-31.70 수준으로 대 찬이 가장 높게 나타났다. 이러한 결과는 Fig. 1에서 콩 발 효물의 외관상 보이는 색과 비슷한 수준으로 나타났으며, Kim et al. (1998)의 연구에서 곰팡이(A. oryzae)를 이용하 여 콩알메주를 제조하였을 때 40시간이 지난 후 황록색 포자가 생성되었다는 보고와도 비슷한 경향이었다. 이는 콩 발효물의 색은 품종 및 발효정도에 따라 다르게 나타난 것으로 보인다.
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콩 발효물의 효소활성으로 α-amylase와 protease의 활성 도를 측정한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. Amylase는 활성 도에 따라 당분의 감미성분 등의 품질에 관여하기 때문에 중요한 효소로 전분을 가수분해한다고 알려져 있다(Zheng et al., 2011). 콩 발효물의 α-amylase 활성도는 대풍2호와 대찬이 각각 61.52 unit/g 및 56.058 unit/g로 가장 높았으며 선풍이 25.85 unit/g으로 가장 낮은 활성도를 보였다(Fig. 2a). 이는 Kim et al. (1998)의 연구에서 amylase 활성도가 높은 시료는 발효과정에서 당분해율과 이용율이 높았으며 당의 이용율이 낮았던 시료는 amylase 활성도가 낮았다는 보고를 미루어보면 본 실험의 결과에서 대풍2호는 당 분해 및 이용율이 높을 것으로 예측할 수 있었다. Protease는 발 효과정에서 맛을 결정짓는 중요한 인자로 미생물에 의해 아미노산과 polypeptide 등을 생성하며 영양 및 소화율의 중요한 역할을 한다(Jung et al., 2009). Protease 활성도는 Fig. 2의 (b)에서 보듯이 대찬이 521.09 unit/g로 가장 높았 으며 선풍과 우람이 각각 308.32 unit/g 및 311.04 unit/g으 로 가장 낮은 활성도를 나타내었다. 이는 앞서 Table 2에 서 나타난 아미노태질소 함량의 결과에서와 비슷한 양상을 보였다. 이것은 Lee et al. (2014)의 연구에서 콩 발효과정 에서 환경조건에 따라 protease 활성도가 다르다고 보고 하 였는데, 본 실험에서도 콩 품종 및 발효과정에서 환경조건 에 따라 미생물의 이용정도가 다르므로 품종별로 차이가 있으며 이는 품질에도 영향을 미칠 것으로 사료된다.
품종별 곰팡이 이용 콩 발효물의 유리아미노산 함량을 측정한 결과는 Table 4에서 보는 바와 같다. 콩의 주요 요 소는 아미노산으로 맛과 영양, 소화율 등을 높이고 여러 가지 건강상의 이로움을 주는 것으로 알려져 있다(Zheng et al., 2011). 유리 아미노산 함량은 glutamic acid가 가장 많이 검출되었고 그 다음으로 lysine, alanine, aspartic acid 등 순으로 함량이 높았다. 총 유리아미노산 함량은 대풍2 호가 595.45 mg/100 g으로 가장 높았으며, 그 다음으로 대찬 이 503.95 mg/100 g, 우람이 402.08 mg/100 g, 선풍이 384.92 mg/100 g, 대원콩이 362.77 mg/100 g, 태광콩이 289.40 mg/ 100 g 순으로 나타났다. 이는 앞서 결과에서 단백질 함량 (Table 1), 아미노태질소 함량(Table 2) 및 효소 활성도(Fig. 2)와 비슷한 결과를 보였다. 곰팡이 이용 콩 발효물은 아 미노산 중에서 맛에 영향을 주는 구수한 맛(glutamic acid, aspartic acid)은 대찬이 가장 높았고, 쓴맛(valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine)은 대풍2호와 대찬이 높 았으며, 단맛(alanine, glycine, lysine)은 대풍2호와 대찬이 가장 높게 나타났다. 이러한 콩 발효물의 맛은 다양한 효 소에 의해 단백질이 분해되어 유리아미노산이 생성되고 이 러한 것들이 어우러지면서 특유의 맛과 향미를 갖게 해주 며, protease의 활성도와 연관성이 있는 것으로 보고하였다 (Rozan et al., 2000;Shin et al., 2019). 또한 Gil et al. (2016)은 발효된 콩의 유리아미노산 함량은 콩 품종에 따 라 다르게 나타났고 그 중 glutamic acid가 가장 많이 검 출되었다는 보고와 본 실험결과와 거의 유사하였다. 따라 서 품종별 곰팡이 이용 콩 발효물의 유리아미노산 함량은 제품의 맛과 향미, 유효성분 등이 고품질 기준에 영향을 미칠 것으로 사료된다.
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요 약
본 연구에서는 콩 품종별 전통장류 유래 Aspergillus spp. 이용 발효물을 제조하여 발효특성을 비교 분석하였다. 품종별 원료콩의 조지방 함량은 18.28-19.15%, 조단백질 함량은 36.49-38.72%로 품종간 차이를 보였다. 콩 발효물 의 외관특성은 품종별로 다른 양상을 보였지만 대부분의 발효물에서 곰팡이가 잘 형성되었으며 대원콩과 대찬은 비 슷한 황록색 포자가 형성되었음을 확인할 수 있었다. 콩 발효물의 pH는 6.31-6.60, TA는 0.36-0.48 범위로 나타났 으며, 아미노태질소은 641.23-791.12 mg% 수준으로 대찬이 가장 높은 함량을 나타내었다. 곰팡이수는 품종별로 7.63- 9.20 log CFU/g 범위의 수준으로 대찬이 가장 많은 편으로 나타났다. 색도의 경우 L값은 59.52-71.28, a값은 0.11-3.03 으로 나타났으며, b값은 14.61-31.70 수준으로 대찬이 가장 높았다. 효소활성도를 측정한 결과 α-amylase는 대풍2호, protease는 대찬으로 제조한 콩 발효물이 높은 활성도를 보 였다. 유리아미노산 함량은 glutamic acid가 가장 많이 검 출되었고 그 다음으로 lysine, alanine, aspartic acid 등의 순으로 함량이 높게 나타났다. 이상으로 결과로 곰팡이 이 용 콩 발효물의 발효특성으로 우수한 품종은 대풍2호와 대 찬이 좋을 것으로 보이며 콩 발효물의 고품질화를 위한 체 계적인 기준이 마련되어야 할 것이다.
