탈지유채박으로부터 추출된 표면활성물질 중 Sinapine 제거에 관한 연구

유채박은 2011년산 잡종박으로 농촌진흥청 국립식량과학 원 바이오에너지작물센터에서 공급받아 -70°C deep freezer (DF-8514, Ilshin Lab. Co. Ltd., Daejeon, Korea)에서 보관 하면서 시료로 사용하였다. 표준물질 phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), sinapic acid는 Sigma 사(St. Louis, MO, USA)에서, sinapine은 Chem Faces사 (Wuhan, China)에서 구입하여 사용하였고, 대두 레시틴은 ㈜일신웰스(Cheongwon, Korea)에서 제공받아 사용하였으 며 이외 실험에 사용한 모든 시약은 특급 이상의 등급을 사용하였다.

탈지 유채박 중 표면활성 추출물의 제조는 이전 연구 (Kim et al., 2013a)에서 얻은 추출 최적조건인 추출압력 150 bar, 추출온도 65°C, 보조 용매량(에탄올) 250 g을 사 용하여 초임계 추출·획득하였다. 이때 1회 추출에 사용된 탈지 유채박은 50 g으로 하였으며, 수기에 포집된 추출물 은 감압농축기(NE-1000SW, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용 하여 에탄올을 완전히 제거한 후 -20°C 냉동 보관하면서 표면활성물질 시료로 사용하였다.

표면활성물질 추출물 중 sinapine 제거과정은 Fig. 1에 나타냈다. 즉, 표면활성추출물(200 mg)을 시험관에 취하고 증류수(30-fold, w/w)를 이용하여 완전히 분산/용해하였다. 여기에 혼합용매(diethylether:ethyl acetate = 1:1, v/v)를 넣 고(35-fold, 시료무게 기준) 혼합한 후 포화 염화나트륨 용 액을 적량 첨가하여 원심분리(3,000 × g, 5분)한 후, 상등액 (supernatant ①, solvent layer)을 취하고 질소(N₂)를 이용하 여 혼합용매가 완전히 제거된 ppt I (②) 및 잔유물(residue ③)을 얻었으며, ppt I은 다시 과정(I)을 2회 더 처리하여 순도를 높였다. 한편, 잔유물 ③은 감압농축기를 이용하여 수분을 완전히 제거한 후 에탄올을 소량 첨가하여 용해·원 심분리 하여 상등액(supernatant ④)을 취하고, 에탄올을 제 거하여 ppt II(⑤) 및 잔유물(residues ⑥)을 얻었으며, ppt II는 다시 과정(I)과 (II)를 2회 반복하여 순도를 높였다. 이 상의 모든 과정에서 얻은 ppt I, II 및 잔유물을 수집하여 이를 각각 최종 ‘정제 표면활성 물질’ 및 ‘잔유물(residues)’ 시료로 하였다.

Fig. 1. Procedure of sinapine removal in surface-active substances extracted from defatted rapeseed cake.

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정제된 표면활성물질은 20 mg/mL의 농도로 준비하여 TLC plate (100 × 100 mm, silica gel 60 F254, 0.5 mm, Merck Co., Darmstadt, Germany)에 8 µL씩 spotting한 후 전 개용매(chloroform:methanol: acetic acid:water = 170:25:25:6, v/v/v/v)를 이용하여 전개 시켰다(Smiles et al., 1989). 전개 가 완료된 TLC plate는 상온에서 5분간 건조하고 포화 요 오드(I₂) 탱크에 넣어 5분간 발색시킨 후 표준물질(PC, PE, sinapic acid, sinapine)의 Rf (retention factor)와 비교 확인 하였다.

시료 10 mg을 0.1% phosphoric acid (v/v)가 함유된 10% methanol 1 mL에 첨가하여 shaking bath (37°C, 3시간 )에서 추출한 후 원심분리(14,000 × g, 10°C, 10분)하고, 상 등액을 취하여 0.45 µm syringe filter로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. HPLC 분석 조건은 Table 1에 나타내었다(Satu et al., 2003).

정제된 표면활성물질을 n-tetradecane에 농도별(10^-1-10^-5 wt%)로 용해시키고 5 mM bis-Tris (pH 7)를 수상으로 하여 oil-in-water 계면을 형성하였다. 측정은 Du Nouy Ring 방 법을 채택하였으며(Shaw, 1992; Couper, 1993), 계면 형성 30분 후에 표면장력계(Attension sigma 700, Biolin Scientific Inc., Stokholm, Sweden)를 이용하여 계면장력을 측정하 였다.

정제된 표면활성물질 일정량을 유상(oil phase)인 카놀라 유(canola oil)에 용해한 후 수상(20 mM bis-tris, pH 7, 0.02% sodium azide)과 혼합하고 이를 혼합기(L4RT, Silverson Machine Chesham, UK)를 이용하여 5000 rpm에 서 5분 동안 예비균질 하였다(표면활성물질 0.3 wt%, 카놀 라유 10 wt%, 20 mM bis-Tris, pH 7). 예비 균질액은 고 압균질기(M-110Y, Microfludics, MA, USA)를 총 3회 통 과(3000 psi: 2번, 500 psi: 1번)시켜 최종 유화액을 제조하 였으며(Kim et al., 2013b), 유화액 중 분산되어 있는 지방 구의 크기는 입도분석기(Malvern Master Sizer S, Malvern Co., Worcestershire, UK)를 사용하여 측정하고 측정결과는 volume-surface mean diameter (d₃₂) 및 weight mean diameter (d₄₃)로 표시하였다(McClements, 2005).

d₃₂=Σd_i³n_i /Σd_i²n_i (n_i: numbers of particle on size d_i)

d₄₃=Σd_i⁴n_i /Σd_i³n_i (n_i: numbers of particle on size d_i)

본 실험은 3회 반복 측정하여 평균값과 표준편차로 나타 냈고, 평균값 간의 유의성 검정은 SAS ver. 9.4 (SAS, 2015, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 ANOVA 분석 후 p < 0.05에서 Duncan’s multiple range test로 실시 하였다.

이전 연구(Kim et al., 2013a)에서 얻은 최적 추출 조건 (추출압력 150 bar, 추출온도 65°C, 보조용매량(에탄올) 250 g)을 이용하여 탈지 유채박으로부터 표면활성물질(이 하 비정제 표면활성물질)을 추출하고, 이를 Fig. 1의 절차 에 따라 sinapine이 제거된 정제 표면활성물질을 얻었다. Fig. 2는 일련의 용매 추출·정제과정(Fig. 1)에 따른 sinapine 분획의 이동 형태를 보여주고 있다. Lane 1-3은 각각 sinapic acid, PC와 PE 및 sinapine 표준물질이고, lane 5는 정제 표면활성물질의 크로마토그램으로 sinapine이 본 정제 과정을 통하여 제거되었음을 알 수 있었고, 제거된 sinapine은 잔유물(lane 6)에 존재하고 있음이 확인되었다.

Fig. 2. Thin-layer chromatogram of surface-active substances extracted from defatted rapeseed cake. Lane (1) sinapic acid (band a, standard); Lane (2) phosphatidylethanolamine (band b, standard) and phosphatidylcholine (band c, standard); Lane (3) sinapine (band d, standard); Lane (4) surface-active substances (not-purified); Lane (5) surface-active substances (purified); Lane (6) residues.

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Fig. 3과 Table 2는 비정제, 정제 표면활성 물질 및 잔유 물(residues) 중의 sinapine에 대한 정량분석 결과를 나타내 고 있다. 비정제 표면활성 물질과 잔유물 중의 sinapine 함 량은 각각 505.75±0.05 mg/g, 480.88±0.07 mg/g으로 높게 나타났으며, 반면 정제 표면활성 물질에서는 검출되지 않았 다. 이 결과는 본 실험에서 시도된 정제방법이 Dabrowski & Siemieniak (1987)의 methanol-ammonia water 혼합용매 시스템을 이용하는 방법에 비하여 sinapine 제거에 있어서 매우 효과적이었음을 보여주고 있다.

Fig. 3. HPLC Chromatogram of sinapine in not-purified, purified surface-active substances and residues. (A) sinapine (standard); (B) not-purified surface active substances; (C) purified surface-active substances; (D) residues.

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Fig. 4와 Table 3은 정제표면활성 물질의 유화특성을 나 타내는 계면장력과 유화액지방구 크기의 측정 결과이다. Fig. 4에 나타난 대로 정제표면활성 물질의 첨가 농도가 증가할수록 계면장력은 낮아졌으며[32.33±1.06 mN/m (10^-5 wt%)에서 3.20±0.57 mN/m (10^-1 wt%)], 이는 비정제 표면 활성물질의 계면장력(10^-1 wt%; 14.16±0.27 mN/m) (Kim et al., 2013b) 보다 매우 낮은 수준이었다. 또한 정제, 비 정제 표면활성 물질 및 대두 레시틴을 각각 0.3 wt% 첨가 하여 유화액을 제조하여 지방구 크기를 조사한 결과(Table 3), 지방구 크기(d₄₃)는 각각 정제 표면활성물질 유화액이 가장 작고, 비정제 표면활성물질, 대두 레시틴 순으로 나 타났다(0.64±0.01 µm < 1.02±0.06 µm < 2.79±0.21 µm). 이 는 추출물 정제과정을 통하여 sinapine 제거에 따라 상대적 으로 유화 성분인 인지질의 함량이 증가하여 나타난 결과 로 생각되었으며, 또한 본 정제물은 대두 레시틴 보다 유 화기능이 우수함을 시사하고 있다.

Fig. 4. Changes in interfacial tension of purified surface-active substances with respect to concentration.

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따라서 상기 결과에 근거하여 본 정제 표면활성 물질은 유채박 중에 존재하는 sinapine이 제거되고 동시에 항산화 물질인 sinapic acid가 함유되어 있으며(Wang et al., 2014), 또한 기존 대두 레시틴보다 유화특성(계면장력, 지방구 크 기 등)이 우수하므로 식품용 유화제로서 적용이 가능한 후 보 물질로 판단되었다.