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서 론
최근 우리나라는 생활수준의 향상과 더불어 보건의료 기 술의 발달로 노인인구가 급격히 증가하고 있다. 일반적으 로 의·약학분야에서 노인을 일컬을 때는 65세 이상을 뜻하 고 있으며, 통계청 자료에 의하면 우리나라의 평균 수명은 연간 0.5세씩 증가할 만큼 큰 상승률을 보이고 있다(Kang & Kim, 2005; Korean Statistical Information Service, 2013). 2015년 경제협력개발기구(OECD) 발표에 의하면, OECD 회원국의 남녀기대수명 격차는 에스토니아, 폴란드, 슬로바키아, 헝가리 다음으로 5위를 차지하고 있으며, 2013년 태어난 한국 아이를 기준으로 우리나라 국민의 평 균 기대수명은 81.8세를 추정하고 있다(OECD Statistics, 2015). 이러한 고령화 인구의 증가와 더불어 삶의 질을 향 상시키고 건강한 삶을 유지하기 위해서는 고령친화산업 부 분에 대한 연구가 절실히 요구되고 있다. 특히 ‘건강한 삶’ 을 유지하기 위해서는 영양섭취가 매우 중요하며, 이는 가 장 기본적인 음식을 씹고 삼키는 기능이 쇠퇴한 노인들에 게 있어 매우 중요하다.
영양학적인 측면에서 봤을 때, Lee & Lee (1999) 및 Choi et al. (2010)의 연구에 따르면, 저작불능에 의한 군이 그렇지 않은 군보다 곡류와 채소류의 섭취량이 유의적으로 적었다고 보고하고 있으며, 이는 결과적으로 비타민이나 무기질의 섭취가 부족한 것을 예측할 수 있다. 특히 지용 성 영양소인 비타민 A는 고령자에게 저작이 어려운 채소 인 당근에 많이 포함되어있다. 일반적으로 당근은 우리나 라 음식 문화에서 빠질 수 없는 기본 식재료이며, 당근의 영양학적 의미는 매우 크다. 대표적인 생리활성 물질로는 카로틴 색소를 함유하고 있는데, 몸에 흡수되면 비타민 A 로 전환되며, 부족할 경우 시력 감퇴뿐만 아니라 야맹증과 같은 각종 안질환에 노출 될 위험이 있다고 알려져 있다 (Shin & Bae, 2001; Yoo et al., 2013). 또한, 항산화 및 항 암효과와 성인병 예방 등의 효능을 가지고 있으며, 한방에 서는 빈혈이나 저혈압 등에 특히 효능이 있기 때문에 약재 로써도 이용된다고 한다.
식재료의 원물 형태는 유지하면서 저작·연하 작용을 돕 기 위한 물성변화에 대한 연구는 이슈화되고 있다(Sakamoto et al., 2006). 이러한 고령자 식품의 제조기술에는 경도제 어기술로써 다양한 함침법이 적용되고 있는데, 이는 식품 의 형상과 영양성분은 손상하지 않고 저작·연하 곤란자에 게 적합한 경도의 식품을 제공하기 위함이다. 본 연구에서 는 효소를 활용한 나노 입자 제조 기술을 도입하였으며, 식재료 내에 균일하게 효소를 침투시켜 함침 효율을 증진 시키고자 하였다. 즉, 효소를 코팅하는 방법으로 리포좀 제 조기술을 이용하였으며, 제조된 리포좀의 입자크기를 나노 입자화하여 식품에 적용하였다. 일반적으로 리포좀은 한 층 또는 여러 층의 지질 이중막으로 구성된 구형의 소포체 를 말하며, 이는 수용성 물질과 지용성 물질을 동시에 포 집할 수 있는 장점을 지니기 때문에 식품에 다양하게 적용 할 수 있다고 알려져 있다(Jin & Yoo, 2001; Oh et al., 2006). 그러므로 수용액 상에 현탁 상태로 존재하는 수용 성 기능성 성분을 비롯한 분해효소, 소화효소 등의 성분을 선택적으로 혹은 복합체로 제형화하여 함침속도, 함침효용, 저장기간에 따른 안정성에 따른 효율성을 부가할 것으로 기대할 수 있다.
고령자의 식생활에서 가장 심각한 문제는 저작(음식물을 씹음)과 연하(삼켜 넘김)의 섭식장애라 할 수 있다. 나이가 들수록 일반적으로 먹는 기능이나 소화·흡수하는 기능이 현저히 떨어진다(Clark & Solomon, 2012; Hwang, 2014). 이러한 저작 기능의 저하는 음식물의 크기에 영향을 미쳐 영양 불량이나 편식을 초래할 수 있으며(Kim, 2013), 구강 ·인두·식도 등의 연하 기능의 저하는 식도로 연하 되어 야 할 식품이나 타액이 기관이나 폐로 들어갈 위험성을 증 가시킨다고 알려져 있다(Choi, 2014). 즉, 이러한 섭식 기 능의 저하는 고령자들에게 있어 식사량을 줄어들게 하며 단백질이나 에너지가 부족한 상태인 저영양 상태에 빠지기 쉽기 때문에 여러 가지 질병에 노출될 가능성이 높다(Rhie et al., 2006). 그러므로 이를 보완하고자 고령자들을 비롯 한 특별한 영양관리가 필요한 특정 대상을 위하여 식품과 영양소를 배합하는 등의 방법으로 제조 가공한 특수용도식 품(special dietary food)의 개발이 필요한 실정이다(Ogoshi & Watanabe, 2013). 특히, 저작·연하 곤란자들을 위한 식 품의 연구개발이 매우 미미하며, 주로 밥과 채소, 육류 등 을 믹서에 갈아 죽과 같은 유동식 형태로 병원에서 환자식 으로 제공되고 있다.
본 연구에서는 비코팅 가수분해효소인 hemicellulase (He) 와 나노리포좀(NL)으로 코팅한 hemicellulase를 통해 고령 자 및 저작 연하자를 위한 당근의 연화 정도(softening)를 확인하였으며, 이화학적 및 관능학적 분석을 통한 품질변 화를 알아보았다.
재료 및 방법
본 연구에서 사용한 당근은 E사 대형 유통마트(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 깨끗이 세척한 후 지름 3 cm, 높 이 1 cm의 크기의 실린더 모양으로 일정하게 제형화하였다. Hemicellulase는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구 입하였고, 코팅제인 레시틴은 Lipoids GmbH (Ludwigshafen, Switzerland)에서 구입하여 사용하였다. 그 외 모든 시약은 분석용을 사용하였다.
2% (w/v) Hemicellulase 용액(피코팅제)에 2% 레시틴 용 액(코팅제)을 혼합 후 high speed homogenizer (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX®, Staufen, Germany)를 이용하여 12,000 rpm으로 3분 동안 균질 하였다. 1차 균질하여 만든 리포좀을 2차 균질 처리를 위해 3분 동안 초음파 처리 (200 W)하여 1% hemicellulase를 self-assembly된 인지질이 이중막으로 코팅하여 나노 크기의 리포좀을 제조하였다.
당근(지름 3 cm, 높이 1 cm)은 증류수(distilled water, DW), hemicellulase (He) 용액, hemicellulase가 코팅된 나노리포 좀(He/NL) 용액에 물관 및 체관면을 제외하고 4°C에서 48 시간동안 침지하였다. 각 시료는 12시간마다 채취하여 거 즈를 이용하여 효소액과 물기를 제거한 후 이화학적 특성 을 분석하였다.
He, NL, He/NL 용액의 평균 입자크기 및 입자분포도는 dynamic light scattering (DSL) 원리에 의해 입도분석기 (Zetasizer Nano-ZS 90, Malvern Instruments, Worcestershire, UK)로 분석하였다. 25°C에서 용매로 쓰인 증류수 기준 광 을 잡고 시료 1 mL을 3회 반복 측정하여 평균값으로 나 타내었다. 시료의 입자크기는 z-average diameter (nm)로 표현되며, 입자분포도는 polydispersity index (PdI)로 나타 내었다. 제타전위(ζ-potential) 측정은 electrophoresis 원리에 의해 입도분석기로 분석하였다. 제타전위는 콜로이드 시스 템의 안정성을 예측하는데 이용하며, 일반적으로 그 값이 +30 mV 이상 또는 -30 mV 이하일 경우 안정하다고 인정 된다. 시료는 25°C에서 전기장을 자동 설정한 후 시료 1 mL 을 취한 후 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다.
색도는 색도계(CR-400, Konica Minolta, Tokyo, Japan) 를 이용하여 DW, He, He/NL 용액에 각각 함침된 당근의 색 변화를 관찰하였다. 실린더 형 당근의 측면을 9회 반복 측정하였다. 측정 전 표준 백색판(L*=97.83, a*=-0.43, b*= 1.98)으로 보정한 후 사용하였으며 L* (명도, lightness), a* (적색도, redness)와 b* (황색도, yellowness) 값으로 나타내 었다. 동시에 색차(ΔE) 비교를 위해 효소 처리한 당근의 색도 변화 값을 생시료에 대비하여 아래의 공식에 대입하 여 색차 값을 산출하였다.
L1: 생시료의 L값, L2: 처리구의 L값
a1: 생시료의 a값, a2: 처리구의 a값
b1: 생시료의 b값, b2: 처리구의 b값
각 시료의 경도는 texture analyzer (CT3-1000, Brookfield Engineering Laboratories Inc., Stoughton, MA, USA)를 사 용하여 측정하였다. 시간에 따라 hemicellulase가 당근 내 부로 확산되어 침투되는 정도에 따른 변화를 관찰하기 위 해 시료를 세 부분으로 절단한 다음 중심과 외곽 부위를 나누어 측정하였다. TPA (Texture Profile Analysis) type에 서 target value는 5.0 mm이었으며, trigger load는 70 g, test speed는 2.5 mm/s의 속도로 측정하였다. TA3/100 probe와 TA-SBA fixture를 사용하였으며, 각 시료의 측정 치는 5회 이상 반복 실험하여 평균값과 표준편차로 표시하 였다.
당근의 미세조직을 CCD 카메라(3.0M, Olympus, Shinjuku, Japan)가 연결된 광학현미경(Olympus CX31, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 시료를 얇게 편을 떠서(5 mm × 5 mm × 1 mm) 약 10 μL의 증류수를 slide glass에 떨 어뜨린 후 cover glass를 덮어 관찰하였다.
각 시료 별로 시간에 따른 hemicellulase의 활성 변화를 측정하고자 Jeong (2000)의 방법을 일부 변형하여 진행하 였다. 0.05 M sodium citrate buffer (pH 4.7) 용액에 녹인 1%(w/v) CMC (carboxymethyl cellulose) 0.5 mL과 각 시 료 0.5 mL을 넣고 혼합한 후 50°C에서 30분간 반응했다. 반응이 끝나면 3,5-dinitrosalicylic acid reagent 3 mL 첨가 후 혼합한 다음, 5분간 가열하여 반응하였다. 반응한 시료 는 차가운 물에서 냉각시켜 반응을 정지시켰다. 그 후, 2 mL 증류수를 넣고 혼합 후 540 nm에서 흡광도를 측정하 였으며, 표준곡선은 표준용 glucose를 사용하였다.
본 실험의 관능검사는 가수분해효소인 hemicellulase 및 리포좀으로 코팅된 효소가 시료의 연화 작용 효과가 있는 지 알아보기 위해 실행하였다. 관능요원은 건국대학교 대 학원생 20명을 패널로 선정하여 본 실험에 관련하여 선호 도, 색의 강도 및 연화정도에 대한 관능검사 설문지에 대 한 사전 교육을 실시한 후 관능검사를 진행하였다. 시료는 증류수, 비코팅 효소 및 코팅 효소액을 침지한 당근을 0, 12, 24 및 48시간동안 함침한 후 꺼내어 평가가 이루어졌 다. 외관의 선호도 및 색의 강도는 선호하거나 색의 강도 가 진한 시료를 높은 숫자를 두어 진행하였고(1번 대단히 싫다-9점 대단히 좋다), 경도는 시료의 단단함이 가장 연화 된 시료를 높은 점수로 하고 단단한 것을 낮은 숫자로 하 여(1점 굉장히 단단하다 – 9점 굉장히 부드럽다) 각 항목 에 대해 느낀 점을 1-9점까지 기입한 후 평균값으로 산정 한 9점 기호 척도법을 사용하였다.
결과 및 고찰
Fig. 1은 hemicellulase (He)와 코팅제인 나노리포좀(NL), 그리고 hemicellulase가 코팅된 나노리포좀(He/NL)의 입자 크기 변화(A)와 제타전위 값(B)을 측정한 결과이다. He의 입자크기는 약 98 nm이며, 나노리포좀의 크기는 약 170 nm로 나타났다. 또한 이들의 제타전위는 모두 음전하를 나 타내었으며, 그 값은 각 -12 mV와 -38 mV로 측정되었다. He/NL의 입자크기는 다소 증가하는 경향을 보였으나 200 nm 이하의 작은 입자크기를 나타내었다. 또한 모든 시료의 입자분산지수는 0.4 이하로 단분상의 분산 형태를 가지며, 입자 분포도가 좁은 균일한 크기를 보여주었다(data not shown). 특히, He/NL의 제타전위는 -40 mV 이상의 값을 보여주었으며, 이는 매우 안정한 나노입자를 생성하였음을 확인할 수 있었다. 본 결과를 통해, 리포좀은 He를 포집하 는데 매우 유용한 소재임을 알 수 있었으며, 효소 및 제조 된 리포좀 시료는 식물소재 식품인 당근에 실제로 적용하 여 침지시간에 따른 이화학적 분석을 진행하였다.
Table 1은 서로 다른 침지액에 따른 당근의 색도변화를 침지 시간에 따라 나타내었다. 시료의 명도(lightness)는 모 든 처리구에서 침지 시간이 길어질수록 감소하는 경향을 보였다. 시간에 따라 He에 침지한 시료의 적색도(redness) 는 유의적으로 감소했지만 증류수와 He/NL에 침지 한 시 료의 적색도는 12시간 후부터 유의적인 차이를 나타내지 않았다(p<0.05). 황색도(yellowness)의 경우, 모든 시료에서 뚜렷한 경향을 나타내지 않았다. 시료의 색차(ΔE)를 살펴 보면, He에 침지한 당근의 색차가 가장 크게 나타났으며, 이에 반해 He/NL에 침지한 당근은 색차는 시간이 지남에 따라 감소했지만 통계적으로 유의적인 차이를 나타내지 않았다(p<0.05). Lee (2009)의 연구에 따르면 효소를 첨가 한 흑마늘과 생마늘의 색도를 측정하여 비교한 결과, 흑 마늘이 생마늘에 비해 명도가 월등히 감소하지만 적색도 와 황색도는 증가하여 색변화가 일어났음을 보고하였다. Hemicellulase는 당근 속에 있는 다당류의 세포막 성분인 pentosan을 가수 분해시키고 방출시키는데 이는 본 실험에 서 당근의 색 변화를 발생시킨 것으로 보여진다(Kim et al., 2008).
증류수, He, He/NL 침지용액으로 침지한 시료의 경도를 시간에 따라 측정하였으며, 측정결과는 Fig. 2에 나타내었 으며, 당근의 외곽(A)과 중심부(B)의 경도를 모두 보여주 고 있다. 모든 처리구의 경도는 전체적으로 감소하였으며, 당근 중심부와 외곽의 경도를 비교했을 때 외곽보다는 중 심부의 경도가 더 낮은 것으로 나타났다. He에 침지한 시 료의 외곽 부분의 경도는 시간에 따라 점차적으로 감소하 였으며 침지 48시간 후에 급격히 감소하는 경향을 보였으 며, 중심부는 보다 더 큰 폭으로 하였다. He/NL에 침지한 시료의 중심부의 경도는 증류수에 비해 12시간 후에 급격 하게 감소하였고, 그 이후에는 유의적인 차이를 나타내지 않았다(p<0.05). 시료의 중심부의 경우 12시간을 제외한 모 든 처리 시간 대에서 He의 경도보다 He/NL의 경도가 높 은 값으로 측정되었는데, 이는 He와 He/NL 간의 침투 속 도에 따른 차이가 있음을 나타내는 결과이다. 즉, 코팅막이 존재할 경우 식품의 연화를 방지하여 비코팅된 식품보다 물성을 보존하는데 유리하다고 판단된다. 다시 말해, 코팅 막이 효소를 일부 보유하고 있기 때문에 코팅막 밖으로 효 소를 유출시키지 않아 다소 연화작용이 지연된 것이라 생 각할 수 있다. Kim (2014)의 연구에서는 다양한 효소처리 를 이용한 채소류(무, 도라지등)의 식품연화 특성을 조사하 였으며, 본 연구결과와 유사하게 hemicellulase를 포함한 당 분해효소를 이용하여 식품연화에 사용하였을 경우 대조 구에 비하여 모든 처리시료에서 유의적으로 식품을 연화하 는데 효과적이라 발표하였다. 또한, Lim (2014)의 연구에 서 조직대두단백을 단백분해효소로 처리한 결과 대조구의 경도가 가장 높았고, 효소 처리한 시간에 따라 낮은 경도 를 보여, 본 실험과 유사한 경향을 보였다. 본 실험에서는 hemicellulase가 당근의 세포벽에 존재하는 펙틴질과 셀룰 로오스를 제외한 다당류인 hemicellulose를 가수 분해하여 세포벽이 일부 파괴된 것에 기인하여 경도가 감소한 것으 로 판단된다.
Fig. 3는 광학 현미경을 이용하여 당근의 조직을 나타낸 결과이며, 외곽(A)과 중심부(B)의 조직을 서로 다른 침지 액에서 침지시간에 따라 나타내었다. 외곽 부위를 먼저 보 면, 증류수 처리 시료는 모든 처리구에서 세포벽을 잘 유 지하고 관찰된 반면, He 처리 시료는 36시간부터 세포벽 이 붕괴되고 파괴되는 것을 확인할 수 있었다. He/NL 시 료 역시 부분적으로 파괴된 세포벽이 관찰됐지만, 전반적 으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 중심부를 보면 모 든 처리구에서 12시간까지는 뚜렷한 세포벽이 관찰되었고, DW 처리 시료 또한 시간의 경과에 따라서도 세포벽을 유 지하였다. 그러나 He와 He/NL 시료들은 외곽과 마찬가지 로 36시간 반응 시료들은 세포벽이 붕괴되었고 특히 He 시료는 세포벽 형태를 알아보기 힘들었다. 전반적으로 증 류수 처리 시료는 조직을 유지했지만, 코팅/비코팅 효소 함 침액에 침지시켰던 당근 시료는 세포벽이 붕괴되어 형태를 유지 못하는 것을 관찰할 수 있었다.
Fig. 4는 hemicellulase의 활성도를 반영하는 분해산물인 glucose의 함량으로 나타낸 결과이다. Hemicellulase를 식물 성 소재에 넣고 효소의 활성도가 높으면 분해산물인 glucose 생성량이 많아지게 되는데, 이를 이용하여 He과 He/NL의 활성 정도를 비교 분석할 수 있다. 본 실험에서 는 시료 전체를 이용하여 He과 He/NL 간의 glucose 생성 량을 비교 분석하여 나타내었다. He의 경우 glucose 함량 이 시간에 따라 증가하는 경향을 보여주었으나, He/NL 의 경우는 시간에 따른 함량 변화가 적었고, He보다 생성된 glucose 함량이 낮았다. 일반적으로 효소의 활성을 고정시 키는데 이러한 기술이 많이 이용되고 있으며(Brady & Jordaan, 2009), 이는 본 연구에서도 확연히 나타났다. 즉, 리포좀으로 코팅한 hemicellulase의 경우 활성도가 고정되어 코팅막이 없는 경우보다 활성이 낮아 적은 양의 glucose 생 성량을 관찰할 수 있었다.
증류수, He 및 He/NL로 침지 처리한 당근의 함침 시간 에 따른 관능검사 결과는 Fig. 5에 나타내었다. 외관 선호 도는 좋은 것을 높은 점수로 하여 진행하였으며, 24시간동 안 침지시킨 효소 침지액 시료에서 7점 이상으로 가장 높 은 선호도를 나타냈다. 색의 진한 정도를 나타내는 색의 강도 또한 24시간동안 효소액으로 침지시킨 시료에서 8점 으로 높은 선호도를 받았다. 단단한 시료인 당근의 연화정 도를 알 수 있는 경도 부분에서는 가장 연화가 된 것 같 은 시료를 높은 점수로 진행하였는데, 생시료가 가장 낮은 점수를 받아 연화가 안 되고 단단한 것으로 나타났다. 반면 에 전반적으로 효소함침액 및 리포좀 코팅 효소함침액에 침 지시킨 당근 대부분이 5-6점으로 유사하게 나타났으며, 이 는 효소가 첨가될 경우 코팅막에 관계없이 당근의 연화에 효소첨가가 직접적으로 영향을 미치는 것으로 판단된다. 추 가적으로 본 연구에 기초하여 다양한 고령자화 식품개발을 위하여 노인 대상의 관능평가가 필요할 것으로 생각된다.
결 론
식물 소재 식품인 당근을 효소액에 침지 한 시간에 따른 식품의 이화학적 특성 변화를 관찰한 결과, 침지한 효소액 에 따라 분명한 차이점을 나타내었다. 색도에서는 명도가 모든 처리구에서 감소하는 경향을 보였고, 특히 He/NL에 침지한 당근의 경우 적색도와 황색도가 감소하는 경향을 보였다. 또한 He와 He/NL 두 처리구에서 공통적으로 당근 본연의 색을 잃어가는 경향을 나타냈다. 경도 측정 결과 시간에 따라 모든 처리구에서 감소하였고 대체적으로 He 의 경도가 가장 낮았으며, 이는 He/NL 처리된 당근에 비 하여 He 처리한 당근의 물성이 더 연화된 것을 나타낸다. 당근을 침지했던 효소액(He, He/NL)의 활성은 생성물인 glucose의 함량 측정을 통해 He/NL의 활성이 He/NL 보다 높게 나타났고 시간에 따라 그 활성이 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다. 이는 He/NL의 경우 hemicellulas를 둘러싸 고 있는 리포좀 코팅막로 인해 활성되는 속도가 느리다는 것을 나타낸다. 즉, 리포좀과 같은 코팅막을 이용하여 효소 를 고정할 경우 상대적으로 시료 내부로 들어가는 효소의 양이 많아 내부 조직 연화가 먼저 일어나고 특히 시간이 경과함에 따라 효소가 발현되어 연화 기작을 오랫동안 작 용할 수 있기 때문에 추후 고령식 식품개발에 응용할 수 있으리라 판단된다. 또한 다양한 영양성분과 기능성 성분 을 함께 코팅하여 영양가가 높은 함침액 및 연화된 비파괴 노인식 개발에 도움을 줄 것으로 생각된다.
