모시풀잎 에탄올 추출물의 in vitro 항산화 활성

본 실험에 사용한 모시풀잎 분말은 2013년 충남 서천에 서 재배된 모시풀잎을 40℃에서 열풍건조하여 분쇄(100~ 300 μm)한 것으로 서천군 한산모시식품사업단으로부터 제공 받아 -20℃ 냉동실에 보관하면서 사용하였다.

모시풀잎 분말 100 g당 0, 30, 50, 70, 100%의 농도로 에 탄올 각각 1,000 mL를 첨가한 후 항온 진탕조에서 2시간 동안 진탕하여 추출한 다음 Whatman filter paper(No. 2, Whatman International Ltd., Maidstone, UK)로 여과하였다. 여액을 감압농축하여 용매를 제거하고 동결건조시켜 추출물 을 제조하였다.

모시풀잎 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약이 폴리페놀 화합물에 의하여 환원되어 몰리브덴 청색 으로 발색되는 원리를 이용한 방법(Folin & Denis, 1912) 으로 측정하였다. 모시풀잎 추출물 1 mL에 Folin-Ciocalteu 시약 2 mL를 가한 후 상온에서 3분간 정치한 다음 10% Na₂CO₃ 용액 2 mL를 넣고 다시 상온에서 1시간 반응시키 고 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. Chlorogenic acid를 표준물질로 작성한 표준곡선으로 총 폴리페놀 함량을 구한 후 추출물 mg당 μg chlorogenic acid equivalent(CAE)로 표 시하였다.

모시풀잎 추출물의 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거활성은 Blois의 방법(Blois, 1958)을 이용하여 측정하였다. 모시풀잎 추출물 1 mL에 0.15 mM DPPH용액 3mL를 가한 후 상온에서 30분간 반응시킨 다음 525 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 모시풀잎 추출물의 DPPH 라디 칼 소거활성은 (1 −추출물첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡 광도)×100에 의하여 계산하였다. 대조군으로 vitamin C를 사용하여 비교하였다.

모시풀잎 추출물의 환원력은 Oyaizu의 방법(Oyaizu, 1985)으로 측정하였다. 모시풀잎 추출물 1 mL에 0.2M Naphosphate buffer(pH 6.6) 2.5 mL와 1% K₃Fe(CN)₆ 용액 2.5 mL를 가한 후 50℃에서 20분간 반응시킨 다음 10% trichloroacetic acid 용액 2.5 mL를 가하였다. 반응액을 원심 분리(1,000 × g, 25℃, 10분)한 후 상등액 2.5 mL를 취하여 증류수 2.5 mL와 혼합한 다음 0.1% FeCl₃ 용액 0.5 mL를 가하고 700 nm에서 흡광도를 측정하여 환원력으로 나타내 었다. 대조군으로 vitamin C를 사용하였다.

모시풀잎 추출물의 아질산염 소거활성은 Gray와 Dugan 의 방법(Gray & Dugan, 1975)에 따라 측정하였다. 모시풀 잎 추출물 1 mL에 1 mM NaNO₂ 용액 1 mL를 가한 후 0.1 N HCl과 0.2M 구연산 완충액(pH 1.2)를 첨가하여 총 부피를 10 mL로 하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액 1mL를 취하여 2% 초산용액 3mL와 Griess reagent(1% sulfanilic acid in 30% acetic acid : 1% naphthylamine in 30% acetic acid=1:1, v/v) 0.4mL를 차례로 가한 후 실온에서 15 분간 반응시킨 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대 조군으로 vitamin C를 사용하여 비교하였다. 아질산염 소 거활성은 시료 무첨가구에 대한 시료첨가구의 흡광도비(%) 로 나타내었다.

본 연구의 결과는 실험군당 평균±표준편차로 표시하였다. 또한 SPSS(version 11.5, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)로 통계처리 하였으며 ANOVA를 이용하여 Duncan's multiple range test로 5% 수준에서 각 시료간의 유의성을 검증하였 다(p < 0.05).

입도 100~300 μm의 모시풀잎 분말을 에탄올 농도가 상 이한 조건에서 추출물을 제조하여 추출 수율, 추출물 중의 총 폴리페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다. 그 결과(Table 1), 추출 수율은 에탄올 농도가 0%에서 70%까지 증가됨에 따라 서서히 감소하였으며(20.75%→ 15.46%), 에탄올 100% 조건에서는 6.24%의 가장 낮은 수 율을 보였다. 이는 에탄올 농도 증가에 따라 수용성 성분 의 추출량 감소에 기인하는 것으로 고구마에서의 결과 (Kim et al., 2015)와 일치하는 경향이었다. 추출물에 함유 된 총 폴리페놀 함량은 추출 수율과는 반대로 에탄올 농도 증가에 비례하여 증가하였으며 70% 에탄올 조건에서 105.0 μg CAE/mg으로 가장 높은 값을 보였다. 기존에 모 시풀잎 추출물의 총 폴리페놀 함량은 58.70 μg/mg(동결건 조 시료, 70% 에탄올 추출(Park et al., 2011)), 138 μg/mg(열 풍건조 시료, 80% 에탄올 추출(Kim et al., 2014a)), 148.72 μg/ mg(열풍건조 시료, 70% 에탄올 추출(Nho et al., 2010)) 등 으로 보고되어 있어 본 연구의 결과와 상이하였다. 생육시 기에 따라 식물 잎의 항산화제 함량이 변화한다는 보고 (Kang et al., 2004)와 재배조건에 따라 고구마 항산화 성 분이 변화한다는 보고(Woo et al., 2012)를 고려하면 이러 한 차이는 시료의 특성 차이에 기인하는 것으로 사료된다. 일부 국내 식용 식물 중 쑥(메탄올 추출물, 55.6 μg/mg(Lee et al., 2011b)), 녹차(열수 추출물, 85.62 μg/mg(Jeong et al., 2009)), 고구마잎(80% 에탄올 추출물, 46.26~85.10 μg/mg(Li et al., 2012))과 비교하여도 모시풀잎(70% 에탄올 추출물, 105.0 μg/mg)의 폴리페놀 함량이 매우 높은 것으로 분석되 었다. 에탄올 농도 증가에 따라 각 추출물의 DPPH 라디 칼 소거활성은 총 폴리페놀 함량과 비례하였으며, 식물에 널리 존재하는 이차 대사물인 폴리페놀 성분은 구조적으로 phenolic hydroxyl기가 존재하므로 항산화 능력을 갖는 것으 로 알려져 있으므로(Amin & Yazdnparast, 2007), 총 폴리페 놀 함량이 가장 높고 DPPH 라디칼 소거활성이 가장 우수 한 70% 에탄올 추출물을 항산화 활성 측정에 이용하였다.

DPPH는 비교적 안정한 free radical을 갖는 화합물로 항산 화제에 의하여 환원되면 색이 탈색되는 원리를 이용하여 천 연물로부터 항산화 활성을 분석하는데 자주 사용되고 있다. 모시풀잎 70% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성 결 과를 Fig. 1A에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거활성은 모시 풀잎 추출물의 농도에 비례하여 증가하였으며, 52.5 μg/mL의 농도에서 71.6%의 소거활성을 보였다. DPPH 라디칼의 50% 를 소거하는 농도인 EC₅₀은 에탄올 추출물과 vitamin C에서 각각 34.72 μg/mL과 4.65 μg/mL로 계산되어(Table 2) 천연 항산화제 vitamin C에 비해 모시풀잎 추출물의 활성이 낮게 나타났다. 그러나, 모시풀잎 추출물에는 다양한 화합물이 포 함되어 있고 vitamin C는 단일 물질인 것을 고려하면 모시 풀잎 추출물의 유리 아리칼 소거활성이 상당히 우수한 것으 로 사료된다. Paik 등(2010)의 연구에서 모시풀잎 에탄올 추 출물의 DPPH 라디칼 소거활성은 500 μg/mL에서 51.5%를, Kim 등(2014a)의 연구에서는 열풍건조 모시풀잎 80% 에탄 올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성은 1,000 μg/mL에서 77.7%를 보여 본 연구의 라디칼 소거활성이 우수한 것으로 나타났다. 또한 Nho 등(2010)은 모시풀잎 70% 에탄올 추출 물의 DPPH 라디칼 소거활성의 EC₅₀을 688 μg/mL로, Park 등(2011)은 동일한 70% 에탄올 추출물에 대하여 EC₅₀을 23.76 μg/mL로 보고하여 본 연구 결과와 상이하였다. 이는 총 폴리페놀 함량의 결과와 동일하게 시료의 특성 차이에 기인하는 것으로 판단된다. 본 연구의 DPPH 라디칼 소거활 성에 대한 EC₅₀은 식용 식물 중 고구마잎 80% 에탄올 추출 물의 109~168 μg/mL(Li et al., 2012), 곤드레잎 물 추출물의 87.1 μg/mL(Lee et al., 2011b), 에탄올 추출물의 111.19 μg/ mL(Lee et al., 2006)보다 낮아 모시풀잎이 매우 우수한 전자 공여 활성을 갖는 것으로 조사되었다.

Fig. 1. DPPH radical scavenging ability (panel A), reducing power (panel B) and nitrite scavenging ability (panel C) of ramie (Boehmeria nivea L.) leaves extracts prepared with 70% ethanol solution. Data were means and SD of triplicate measurements.

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항산화 작용의 여러 기작 중 활성 산소종 및 유리기에 전자를 공여하는 능력이 환원력이므로, ferri-ferricyanide (Fe³⁺)혼합물이 수소를 공여하여 ferrous(Fe²⁺)로 전환시키는 능력을 흡광도 값으로 표시하여 항산화 활성의 검증에 활 용한다. 환원력이 강할수록 높은 흡광도 값을 나타낸다. 모 시풀잎 70% 에탄올 추출물의 환원력 결과를 Fig. 1B에 나 타내었다. DPPH 라디칼 소거능과 동일하게 환원력은 모시 풀잎 추출물의 농도에 비례하여 증가하였으며, 113.9 μg/ mL 농도에서 흡광도는 1.21까지 증가하였다. 반응액의 흡 광도가 0.5가 되는데 필요한 농도를 나타내는 EC₅₀은 에탄 올 추출물과 vitamin C에서 각각 44.39 μg/mL과 6.69 μg/ mL로 나타났으며(Table 2), 이 역시 천연 항산화제 vitamin C의 활성이 우수하였다. 모시풀잎 추출물의 환원력에 관한 기존의 연구결과는 매우 미미하였고, 식용 식물 중 자색 고 구마 70% 에탄올 추출물의 EC₅₀은 236 μg/mL(Kim et al., 2015), 복분자와 오디 60% acetone 추출물은 각각 871 μg/ mL과 746 μg/mL(Jun et al., 2014)으로 보고되어 본 연구의 44.39 μg/mL보다 높아 모시풀잎 추출물이 매우 우수한 환원 력을 갖는 것으로 나타났다.

아질산염은 식품 중에 존재하는 아민류와 반응하여 발 암물질인 nitrosamine을 생성한다. 이러한 아질산과 아민 류를 함유하고 있는 식품을 섭취하였을 때 발암물질인 nitrosamine이 생성될 가능성이 높으며 특히 산성조건에서 쉽게 진행되는 것으로 알려져 있다(Leaf et al., 1987).

Nitrosamine의 생성을 억제하기 위하여 위장 조건과 유사 한 pH 1.2에서 모시풀잎 70% 에탄올 추출물의 아질산염 소거활성을 측정하여 Fig. 1C에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거능, 환원력과 동일하게 아질산염 소거활성은 모시풀잎 추출물의 농도에 비례하여 증가하였으며, 92.8 μg/mL의 농 도에서 60.8%의 소거활성을 보였다. 동시에 아질산염의 50%를 소거하는 농도인 EC₅₀은 에탄올 추출물과 vitamin C에서 각각 52.99 μg/mL와 15.45 μg/mL였으며(Table 2), DPPH 라디칼 소거능 및 환원력과 동일한 경향이었다. 모 시풀잎 추출물의 아질산염 소거활성에 관한 보고는 매우 미미하며, 본 연구의 결과를, 쑥 에탄올 추출물이 pH 1.2, 1.0 mg/mL의 농도에서 41%의 아질산염 소거 효과를 보인 다는 결과(Park & Kim, 2006)와 비교하면 모시풀잎 추출 물이 매우 우수한 아질산염 소거활성을 갖는 것으로 나타 났다. 폴리페놀 화합물은 발암성 nitrosamine의 생성 억제 에 효과가 있으며 페놀화합물의 함량이 높을수록 산성조건 에서 아질산염의 소거효과가 우수하다는 보고(Mirvish, 1995)와도 잘 일치하였다. 따라서 모시풀잎 추출물은 nitrosamine의 직접적인 생성 원인인 아질산을 효과적으로 분해할 가능성이 높은 것으로 판단되었다.

이상의 결과에서 모시풀잎 70% 에탄올 추출물은 천연 항산화제인 vitamin C보다 라디칼 소거활성, 환원력, 아질 산염 소거활성 측면에서 낮은 항산화력을 갖는 것으로 나 타났으나 모시풀잎 추출물이 단일성분이 아닌 추출물임을 고려한다면 우수한 항산화력을 갖는 것으로 사료된다. 모 시풀잎의 항산화 성분에 대하여는 chlorogenic acid가 항산 화 활성을 포함한 다양한 생리활성을 갖는 중요한 화합물 (Tan et al., 2014)이며, 에탄올 추출물의 ethyl acetate 분획 에서 (-)epicatechin과 (-)epicatechin gallate가 DPPH 라디칼 소거활성을 보이는 성분(Nho et al., 2010)으로 보고되어 있다. 향후 모시풀잎 추출물 성분의 분리와 구조분석 연구 를 통하여 DPPH 라디칼 소거활성뿐만 아니라 환원력과 아질산염 소거활성이 우수한 모시풀잎 유래의 천연 항산화 성분을 추가로 규명할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 모 시풀잎 추출물은 항산화 기능성 식품이나 첨가물로 이용될 수 있을 것이다.