아로니아 막걸리의 안토시아닌 안정성

본 실험에 사용한 백미는 경기도 안성시 석정동 소재 농 협 하나로 마트에서 구매한 국내산 안성마춤쌀을 사용했으 며, 아로니아는 경북 영천의 아로니아 재배농장에서 수확 한 것을 구입하여 사용하였다. 발효제는 경기도막걸리세계 화 사업단에서 제조한 입국과 한국효소에서 구입한 개량누 룩을 사용하였으며, 효모는 La Parisienne(Brown yeast, Vision corporation, Seoul, Korea)을 사용하였다.

발효제의 당화력(SP)과 단백분해력(SAP)은 식품첨가물공 전(KFAC, 2013)에 따라 분석하였다. 산도는 국세청 주류 분석규정(NTS, 2010)에 따라 분석하였으며, 발효제의 수분 함량은 적외선 수분 측정기 (Model MX-50, AND, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.

백미는 세미 후 2시간 동안 물에 침지하고 30분 동안 물 빼기 후 100°C에서 증미기(MODEL-1, Bluebrewlab, Seongnam, Korea)를 이용하여 2시간 동안 증미하고 실온 에서 냉각한 다음 양조에 이용하였다. 아로니아는 믹서기 (SY-3500, Samyang Electronics, Gimpo, Korea)를 이용하 여 분쇄한 뒤 막걸리 술덧 담금 시 첨가하였다. 막걸리 담 금 조건은 Table 1과 같으며, 담금 순서는 Fig. 1과 같다. 발효제에 따라 담금 방식의 차이가 있는데 입국을 사용할 때에는 주모 담금을 하여 48시간 발효 후 1단 담금을 실 시하였다. 개량누룩을 사용한 막걸리 술덧 담금 시 보산은 1단 담금 시 젖산(Lactic acid 85-92%, Samchun Chemical, Pyeongtaek, Korea)을 이용하여 pH를 조절하였다.

Fig. 1. Schematic diagram of makgeolli sul-dut fermentation; (A) Ipguk method, (B) Nuruk method.

Download Original Figure

막걸리의 발효 기간 중 알코올 함량은 국세청 주류분석 규정(NTS, 2010)에 따라 시료 100 mL을 메스실린더에 취 하고 15 mL의 물로 2회 씻은 액을 합쳐서 500 mL 플라 스크에 옮긴 후 냉각기에 연결하여 증류시킨 후 증류액 80 mL를 메스실린더에 회수한 다음 100 mL까지 증류수로 채운 후 density meter(DMA 35 portable density meter, Anton Paar, Wundschuh, Austria-Europe)를 이용하여 20°C 에서 측정하였다.

적정 산도는 국세청 주류분석규정(NTS, 2010)에 따라 10 mL의 시료를 취하여 B.T.B & N.R 혼합지시약 (Bromothymol Blue 0.2 g, Neutral Red 0.1 g, 95% ethyl alcohol 300 mL)을 2-3방울 떨어뜨린 다음 0.1 N NaOH로 중화 적정한 후 젖산으로 환산하여 표시하였다. pH는 pH meter(HI2215-02, HANNA Instruments, Woonsocket, RI, USA)로 측정하였다.

시료의 환원당 함량은Dinitrosalicylic acid(DNS)법(Chae et al., 2008)에 따라 분광광도계(Genesys 10-S, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA)를 이용하여 측정하였으 며 표준당은 포도당으로 하여 환원당으로 계산하였다.

시료를 원심분리기를 이용하여 4,500 rpm에서 15분간 원 심분리한 다음 상등액을 취하여 syringe filter(Nylon, 0.45 μm 13 mm)를 이용하여 여과한 후 당도계(HI 96811 Wine refractometer, HANNA Instruments, Woonsocket, RI, USA)를 이용하여 측정하였다.

시료를 원심분리기를 이용하여 4,500 rpm에서 15분간 원 심분리한 다음 상등액을 취하여 실험에 이용하였다. 색도 는 색차계(CR-400, Konica Minolta, Osaka, Japan)를 이용 하여 명도(L), 적색도(a), 황색도(b)를 측정하여 Hunter’s color value로 나타내었다.

시료를 원심분리기를 이용하여 4500 rpm에서 15분간 원 심분리한 다음 상등액을 취한 후 Syringe filter(Nylon, 0.45 μm 13 mm)를 이용하여 여과한 후 시료 10 μL를 Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm, 5.0 μm, Agilent, Santa Clara, CA, USA) column을 사용하여 HPLC(HP 1200 series, Agilent, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였으며, diode array detector(Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 검 출기로 사용하였다. HPLC의 작동 조건은 Table 2와 같다. 이 때 mobile phase는 8분 까지 용매 A를 95%로 하였고, 8분부터는 90%, 13분부터는 85%, 25분부터는 80%, 28 분부터는 70%, 35분부터는 다시 95%로 조절하였다.

본 연구에 사용된 아로니아의 이화학적 분석 결과는 Table 3에 나타내었다. 아로니아의 환원당은 2.73 mg/mL, 산도는0.66%, pH는 4.03으로 나타났다. 아로니아의 총 안토 시아닌 함량은 5368.6 mg/kg이었으며, 안토시아닌 조성은 cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-galactoside, cyanidin-3- arabinoside, cyanidin-3-xyloside 등 총 4가지로 함량은 각각 187.9, 3677.1, 1277.5, 226.1mg/kg로 cyaniding-3-galactoside 의 함량이 가장 높았다. 이와 같은 결과는 아로니아의 품종 별 총 안토시아닌 함량은 2477.0-6470.0 mg/kg 이며 모든 품종에서 cyanidin-3-galactoside가 가장 높은 함량을 나타내 었다는 보고(Lidija et al., 2012)와 유사하였다.

발효제로 사용한 입국과 개량누룩의 당화력, 산도, 수분 함량의 결과는 Table 4와 같다. 개량누룩의 당화력, 단백질 분해력이 입국에 비해 높게 나타났고, 산도는 입국이 0.76%로 개량누룩의 0.11%보다 높았으며, 수분함량은 개 량누룩과 입국이 각각 6.55, 7.51%로 나타났다.

발효제로 입국(I)과 개량누룩(N)을 이용하여 각각 총 원 료 대비 아로니아를 5, 12, 20% 첨가하여 막걸리 술덧을 발효하였다. 발효과정 중의 알코올, 환원당, 산도 그리고 pH의 변화를 Fig. 2에 나타내었으며, 술덧의 색도는 Fig. 3 에 나타내었다.

Fig. 2. Alcohol contents (A), reducing sugar (B), total acidity (C) and pH (D) of makgeolli sul-dut during fermentation by different amounts of aronia and different kinds of koji(:N-5, Nuruk, Aronia 5%, : N-12, Nuruk, Aronia 12%, : N-20, Nuruk, Aronia 20%, °‰: I-5, Ipguk, Aronia 5%, : I-12, Ipguk, Aronia 12%, : I-20, Ipguk, Aronia 20%).

Download Original Figure

Fig. 3. Hunter’s color of makgeolli sul-dut during fermentation by Nuruk (A) and Ipguk (B). (N-5: Nuruk;aronia 5%, N-12: Nuruk;aronia 12%, N-20: Nuruk, aronia20%, I-5: Ipguk, aronia 5%, I-12: Ipguk, aronia 5%, I-20: Ipguk, aronia 5%).

Download Original Figure

7일 차의 알코올 함량은 입국을 발효제로 사용한 I-5, I- 12, I-20이 각각 15.5, 15.6, 15.0%, 개량누룩을 발효제로 사용한 N-5, N-12, N-20이 각각 14.4, 14.7, 14.2%로 입국 과 개량누룩 시험군 모두 아로니아 20%의 첨가군이 5, 12% 첨가군에 비해 알코올 함량이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 환원당 함량은 2단 담금 2일차에는 증가하는 경 향을 보였지만 발효 일수가 늘어남에 따라 감소하는 경향 을 보였다(Fig. 2). 술덧의 발효 중 환원당의 감소는 알코 올의 생성과 밀접한 관계를 가지며, 특히 발효 과정 중에 는 당의 생성과 알코올로의 전환이 복합적으로 이루어지기 때문에 환원당의 감소와 비례하여 알코올 농도가 증가하는 것으로 판단된다. 7일차의 산도는 입국 시험군에서는 I-20 이 0.61%, 개량 누룩 시험군에서는 N-20이 0.31%로 가장 낮게 나타났는데 이는 알코올 발효의 지연과 상관성이 있 는 것으로 판단되었다(Woo et al., 2010). pH는 입국 시험 군이 3.27-3.85, 개량누룩 시험군이 3.72-4.26의 범위를 유 지하였는데 이는 발효 중 술덧 산도와 상관성이 있는 것으 로 판단되었다.

색도는 두 시험군에서 모두 아로니아 첨가량에 비례하여 a값과 b값이 증가하였으며, 발효제 간 색도를 비교해 보면 입국 시험군의 a값과 b값이 개량누룩 시험군에 비해 높게 나타났다. 이는 두 시험군의 발효 술덧 특성에서 볼 수 있 는 것처럼 입국을 발효제로 사용한 시험군과 개량누룩을 발효제로 사용한 시험군 간 산도와 pH의 차이에 의한 것 이라고 판단되었다.

아로니아 첨가량 별 실험에서 20% 첨가군은 발효제의 종류에 상관없이 알코올 발효가 억제되는 것으로 보아 막 걸리 발효에 있어 아로니아의 양은 20%보다 적게 첨가하 는 것이 바람직할 것으로 생각되었고, 아로니아 5% 첨가 군의 a값의 변화량의 차이가 크지 않아 시험군간 차이 식 별이 명확하지 않을 것으로 생각되었다. 따라서 발효 특성 및 색도 변화를 고려하여 아로니아의 첨가량은 12%로 선 정하였다.

아로니아 안토시아닌의 안정성은 pH와 유기산 등에 의 해 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Hwang et al., 2013). 따라서 본 연구에서는 아로니아 안토시아닌의 안정성에 대 한 pH의 영향을 알아보기 위해 입국을 발효제로 사용한 시험군과 막걸리 양조 산업현장에서 주로 사용하는 젖산으 로 보산하여 pH를 조정한 개량누룩을 발효제로 사용한 시 험군 간의 막걸리 술덧의 발효특성과 색소안정성을 비교하 였다. 발효제로 입국을 사용한 시험군을 A, 개량누룩을 사 용한 시험군을 B, C, D, E로 하였다. B는 보산을 하지 않 은 시험군이며 C, D, E는 젖산을 첨가하여 각각의 pH를 3.0, 3.5, 4.5로 조절한 시험군이었다. 발효 2일과 8일차 발효 profile의 변화는 Table 5에 나타내었다. 발효 8일차 에 알코올 함량은 A시험군이17.8%로 가장 높았고 B 시험 군이 16.8%로 가장 낮았으며, C, D, E 시험군은 각각 17.6, 17.5, 17.3%로 B 시험군보다 높은 함량을 나타내었 다. 발효제를 달리한 시험군 간의 알코올 함량은 입국 담 금 방식과 누룩 담금 방식의 차이에서 기인하는 것으로, 입국 시험군의 발효 시 1단 담금 이전에 주모 담금을 함 으로써 효모의 발육 상태가 개량누룩 시험군에 비해 양호 하기 때문으로 판단되었는데 이와 같이 술덧의 품질 특성 이 발효제에 따라 달라짐은 선행 연구에서도 확인되었다 (So et al., 1999). 발효 8일 차 B, C, D, E 시험군의 환원 당 함량은 각각 1.81, 1.38, 1.51, 1.49 mg/mL로 당이 거의 소비된 것으로 보아 알코올 발효가 종료된 것으로 판단되 었다. 발효 8일차에 A 시험구의 산도, pH는 각각 0.67%, 3.83으로 산도는 가장 높았고 pH는 가장 낮은 값을 나타내 었다. B, C, D, E 시험구의 산도는 각각0.35, 0.37, 0.32, 0.33%였으며, pH는 각각 4.02, 4.17, 4.20, 4.12로 나타나 1단 담금 시 pH 보정 효과가 막걸리 술덧의 발효 종료 시 뚜렷 하게 반영되지 않은 결과를 나타내었는데 이에 대하여는 별 도의 추가 연구를 통한 규명이 필요할 것으로 사료된다.

발효기간에 따른 술덧의 색도 변화(Fig. 4)는 L 값은 2 일 차에 A, B, C, D, E 각각 24.04, 28.43, 26.50, 27.43, 27.26이었던 것이 8일차에는 26.25, 27.93, 27.99, 28.05, 28.30으로 B를 제외하고 모두 증가하는 경향을 보였고 8일차에서 L값은 E가 가장 높았으며 A가 가장 낮았다. 적색도를 나타내는 a값은 2일차에 A, B, C, D, E 각각 11.02, 3.02, 5.79, 4.15, 3.92로 A가 가장 높았으며, B, C, D, E는 술덧의 pH가 높아질수록 a값이 낮게 나타났다. 8일 차에서는 A, B, C, D, E 각각 5.56, 2.16, 2.18, 1.91, 2.03으로 2일 차에 비해 a값이 크게 감소하였으며, 시료 간 a값의 차이는 2일 차의 경향과 유사하게 나타났다. 젖 산으로 pH를 보정한 수용액에서 pH에 따른 아로니아 색 소 안정성 시험과(data not shown), 동일한 pH로 보정한 막걸리 술덧에서의 a값을 각각 비교해보면 막걸리 술덧에 서의 a값이 더 낮게 나타났는데 이는 유기산과 pH 외에도 술덧 중 안토시아닌 배당체 분해 효소 활성, 온도, 광 등 의 영향에 의해 안토시아닌의 분해가 촉진되었기 때문이라 고 판단되었다(Yoon et al., 1997). b값은 a값과 비슷한 경 향을 나타내었고 2일 차에 A, B, C, D, E 각각 6.14, 2.16, 3.06, 2.49, 2.57로 A가 가장 높았으며 B가 가장 낮 게 나타났다. 또한 8일 차에는 A, B, C, D, E 각각 4.46, 2.97, 3.59, 3.27, 2.93로 A를 제외한 모든 시험군은 2일 차에 비해 b값이 증가하였다. 젖산으로 pH를 보정한 시험 군에서는 발효 초기(2일 차)에는 색소 안정화 효과가 있 었지만, 발효 후기(8일 차)에는 모두 a값이 감소하여 pH 무보정시험군과 차이를 나타내지 않았다. 입국 시험군도 발효일수가 경과할수록 a값이 감소하는 경향을 보였지만, 전반적으로 개량누룩시험군보다 높게 나타났다.

Fig. 4. Change of Hunter’s color by different kinds of koji and initial pH. (A: Ipguk, aronia 12%, B: Nuruk, aronia 12%, C: Nuruk, aronia 12%, added lactic acid (pH 3.0), D: Nuruk, aronia 12%, added lactic acid (pH 3.5), E: Nuruk, aronia 12%, added lactic acid (pH 4.5)).

Download Original Figure

아로니아 막걸리술덧의 안토시아닌 조성 및 함량의 변화 는 Table 6에 나타내었다. 색도 a 값의 경시적 변화와 동 일하게 시험군 A에서 총 안토시아닌 함량이 가장 높았으 며, 타 시험군은 시험군 간 총 안토시아닌 함량에서 큰 차 이를 나타내지 않았다. 시험군 A에서 발효 2일 차 cyanidin-3-O-galactoside함량은 68.17 mg/L로 타 시험군 대 비 잔존 농도가 매우 높은 것으로 나타났고, cyanidin-3-Oarabinoside 함량은 발효 2일 차 및 8일 차에서 타 시험 군 대비 3배 이상 잔존하는 것으로 확인되었으며, 미량이 기는 하지만 타 시험군에서는 검출되지 않는 cyanidin-3-Oxyloside가 검출되는 것으로 확인되었는데 이와 같은 결과 는 발효 8일 차 막걸리 술덧의 육안 관찰에 의한 색도 차 이에도 명확하게 반영되고 있는 것으로 확인되었다(data not shown). 한편, 안토시아닌의 안정성에 영향을 미치는 것으로 알려진 pH (Hwang et al., 2013) 효과를 확인하기 위하여 젖산으로 pH를 보정하여 발효를 진행시킨 개량누 룩 시험군 전부에서 pH와 상관없이 유사한 양상으로 안토 시아닌 함량이 매우 낮게 나타나 안토시아닌 함유 기능성 막걸리 양조 시 발효제로는 개량누룩보다는 입국의 사용이 안토시아닌 안정성유지에 적합할 것으로 판단되었다. 이와 같이 입국을 발효제로 사용한 시험군 A와 개량누룩을 발 효제로 사용한 시험군들 간 색소 안정성 차이는 발효 술덧 중 pH의 차이와 본 연구에서 막걸리 술덧의 유기산 조성 을 확인하지는 않았지만 구연산 수용액과 젖산 수용액 중 아로니아 안토시아닌 잔존 농도의 차이(data not shown), 그리고 입국 배양과 개량누룩 배양에 사용된 곰팡이 균종 의 상이함 등을 고려한다면 막걸리 술덧의 발효 기간 중 pH 차이와 유기산 조성 및 발효제에 함유된 β-glucosidase 등 안토시아닌 배당체 분해 효소 활성 차이에 기인하는 것 으로 판단되었다. 따라서, 본 연구에 적용된 아로니아 뿐만 아니라 안토시아닌 함유 원료를 첨가함으로써 막걸리에 안 토시아닌 유래기능성을 효과적으로 부여하기 위하여는 안 정성 개선에 적합한 유기산을 선정하고 안토시아닌 배당체 분해 효소 생산성이 낮은 균종을 배양하여 발효제로 사용 하는 것이 필수적이며 이에 대한 추가연구가 필요할 것으 로 사료된다.