방울토마토(Lycopersicon esculentum var. cerasiforme) Betatini 품종 추출물의 항산화 및 암세포 억제 활성

방울토마토 Betatini 품종은 부여 토마토시험장(Chung- Nam, Korea)에서 2012년에 수확된 것을 사용하였다.

α-α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2’-azinobis-3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid(ABTS), 2,4,6-tripyridyls- triazine(TPTZ) 등 시약은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Chang, Hel299, A549, HeLa, HepG2 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)으로부터 구입하여 사용하였고 α-MEM, RPMI 1640 등 세포 배양 배지 및 시약은 Gibco BRL(Life technologies, Cergy-Pontoise, France)로부터 구입하였다.

방울토마토는 최대한 균일한 크기의 20개 개체를 모아 꼭지를 제거하고 과육을 4-5 mm 두께로 썰어 액체 질소에 담가 급냉시킨 후 동결건조기(PVTFD 10R, Ilsinbiobase Co. Ltd., Donducheon-si, Korea)를 사용하여 건조하였다. 동결건조된 방울토마토를 Wiley mill(Thomas Model 4, Thomas Scientific, Swedesboro, USA)로 곱게 분쇄한 후 20 mesh 체를 통과시켜 분말 시료를 제조하였다.

동결건조 분말 100 mg 당 80%(v/v) 메탄올 50 mL를 가 하여 초음파 수조에 넣고 30°C에서 60분간 추출하였다. 추 출액을 감압 여과한(Whatman No. 2) 후 여액을 분리하여 18,000 g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 회수하여 0.45 μm nylon filter(Millipore, Bedford, MA, USA)를 통 과시켜 여과액을 volumetric flask에 모은 후 80%(v/v) 메 탄올을 가하여 50 mL로 정용하여 메탄올 추출액을 제조하 였다. 추출액을 감압 농축 한(EYELA N-1110, Rikakikai Co. Ltd., Tokyo, Japan) 후 10 mL vial에 옮겨 동결건조하 였다. 메탄올 추출액은 총 폴리페놀 및 총 플리보노이드 함량을 정량하는데 사용하였으며 추출 건조물은 80%(v/v) 메탄올에 농도별로 희석하여 DPPH radical scavenging activity 측정, dimethyl sulfoxide (DMSO)로 희석하여 ABTS radical scavenging activity 및 FRAP assay, 암세포 억제 활성 검증에 사용하였다.

방울토마토 Betatini 품종 메탄올 추출액의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis의 방법(Gutfinger, 1981)을 변형하여 측 정하였다. 추출액 1 mL에 10%(w/v) Na₂CO₃용액을 가하여 혼합하고 상온에서 2분간 방치한 후 Folin ciocalteus reagent 0.5 mL와 증류수 7 mL를 첨가하여 1시간 동안 발 색시켜 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 표 준물질로 0−100 μg/mL 범위에서 표준곡선을 작성하여 검 량식 y = 0.0158x(R²=0.9981)을 얻었으며 이에 따라 총 폴 리페놀 함량을 정량하였다.

추출액의 총 플라보노이드 함량은 Dewanto et al.(2002) 의 방법을 변형하여 측정하였다. 추출액 1 mL를 10 mL volumetric flask에 넣고 60%(v/v) 에탄올 8 mL와 5%(w/v) NaNO₂ 0.2 mL를 순차적으로 첨가하여 6분간 방치하였다. 여기에 0.2 mL 10%(w/v) AlCl3를 첨가하여 6분간 반응시 킨 후 0.6 mL의 4%(w/v) NaOH를 가하고 소량의 증류수 를 첨가하여 10 mL로 정용하였다. 반응액을 415 nm에서 흡광도를 측정하여 총 플라보노이드 함량을 정량하였다. 정량을 위해서는 quercetin을 표준물질로 0–75 μg/mL 범위 에서 표준곡선을 작성하여 검량식 y=0.0028x + 0.0406 (R²=0.993)을 얻었으며 이에 따라 총 폴리페놀 함량을 정 량하였다.

방울토마토 Betatini 품종 추출물의 항산화 활성을 측정 하기 위해 Brand-Williams et al.(1995)의 방법에 따라 α- α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH) free radical 소거활성을 측정하였다. 추출 건조물을 80%(v/v) 메탄올에 각각 50, 100, 250, 500 μg/mL로 농도별로 제조하여 0.8mL를 0.15mM DPPH 0.2mL와 혼합하여 상온에서 30분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거활성은 다음 식에 따라 산출하였으며 DPPH free radical의 생성을 50% 억제하는 시료의 농도를 IC₅₀으로 정의하였다. 양성 대조구 는 합성 항산화제인 butylated hydroxyanisole(BHA)을 사 용하였다.

DPPH radical scavenging activity(DSA, %) = (1–A_sample/ A_blank)×100

ABTS(2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 라디칼 소거활성은 Re et al.(1999)의 방법을 사용하 여 측정하였다. 추출 건조물을 DMSO에 각각 50, 100, 250, 500 μg/mL로 농도별로 제조하였다. ABTS cation radical(ABTS⁺)을 생성시키기 위해 7 mM ABTS 수용액을 만든 후 potassium persulfate를 2.45 mM이 되도록 첨가하 여 빛을 차단하여 상온에서 24시간 보관하여 ABTS⁺용액을 제조하였다. 제조된 ABTS⁺용액을 732 nm에서 흡광도가 0.7±0.02가 되도록 0.1 M phosphate buffer(pH 7.4)로 희석하 여 소거활성 측정에 사용하였다. 농도별로 희석된 추출 건 조물 10 μL와 ABTS^•+용액 990 μL를 혼합하여 1분간 반응 시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거활 성은 다음식에 따라 산출하였으며 ABTS cation radical의 생성을 50% 억제하는 시료의 농도를 IC₅₀으로 정의하였다. 양성 대조구는 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carboxylic acid(Trolox)를 사용하였다.

ABTS radical scavenging activity(ASA, %) = (1–A_sample/ A_blank)×100

방울토마토 Betatini 품종 메탄올 추출물이 Ferric ion (Fe³⁺)을 Ferrous ion(Fe²⁺)로 환원시키는 능력(FRAP)을 Benzie IFF & Strain(1996)의 방법에 따라 측정하여 항산 화력을 알아보았다. TPTZ(2,4,6-tripyridyl-s-triazine) 용액은 40 mM HCl에 ferric-tripyridyltriazine(Fe³⁺-TPTZ)을 10 mM 농도로 용해하여 제조하였다. FRAP reagent는 300 mM acetate buffer(pH 3.6) 100 mL, TPTZ 용액 10 mL, 20 nM FeCl3·6H₂O 10 mL를 혼합하여 제조하였다. 시료의 항산화 력을 측정하기 위해서 시료 60 μL에 FRAP reagent 1.8 mL를 가하고 증류수 180 μL를 첨가하여 37°C에서 4분 간 반응시켜 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 0–2.0 범위에서 측정하였으며 범위를 벗어나면 시료를 희 석하여 측정하였다. 항산화력은 FRAP 값(μmole Fe²⁺/g)으 로 나타내었는데 시료가 생성하는 Ferrous ion (Fe²⁺)의 양 을 FeSO4·7H₂O를 표준물질로 사용하여 이에 상당하는 양 으로 표시하였다. FeSO4·7H₂O(0.1–1 mM)를 사용하여 얻어 진 표준곡선으로부터 검량선(y=0.3283x + 0.0028, R²= 0.9987)을 구하여 방울토마토 메탄올 추출물의 FRAP값을 정량하였다.

방울토마토 Betatini 품종 추출물이 정상세포와 암세포 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 정상 간세포 (Chang), 정상 폐세포(Hel299), 폐암세포(A549), 간암세포 (HepG2), 자궁경부암세포(HeLa)를 사용하여 MTT assay를 실시하였다. 세포주는 α-MEM 또는 RPMI 1640 배지에 10% fetal bovine serum(FBS), 1% Penicillin/Streptomycin을 첨가하여 CO₂ incubator(MCO-20 AIC, Sanyo, San Diego, CA, USA)에서 37°C, 5% CO₂ 하에서 배양, 유지하였다. 배양된 세포를 1×10⁵ cell/well이 되게 96 well plate에 100 μL씩 분주하고 DMSO에 각각 10, 50, 100, 250, 500 μg/mL 농도로 희석된 시료를 10 μL씩 첨가하여 37°C, 5% CO₂ incubator 에서 24 시간 배양하였다. 50 μL MTT solution(0.1 mg/mL)을 각 well에 넣고 37°C에서 4시간 배 양 한 후 100 μL의 DMSO를 첨가하고 microplate reader (Spectra MAX 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 저해 활성은 대조구(DMSO)와 시료의 흡광도 차이를 구하 여 다음과 같이 측정하였다.

% inhibition of cells = 100×(A_blank – A_sample)/A_blank

표준편차, 선형회귀분석 등은 Microsoft Office Excell 2007을 사용하였고 유의성 검정을 위해서는 SAS software 를 사용하여 일원분산분석(one-way ANOVA)을 실시 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하 였다.

식물체에 포함된 폴리페놀 화합물은 항산화 활성을 비롯 한 다양한 기능성을 갖는다는 것은 널리 알려져 있다. 특 히 플라보노이드 성분 중에는 생리활성이나 약리활성을 보 이는 화합물이 다수 알려져 있다. 선행연구(Kim & Ahn, 2014)를 통해 방울토마토 Betatini 품종에 histamine 방출을 억제하여 알러지 억제효능(Yamamoto et al., 2004; Iwamura et al., 2010), 염증억제 효과(Hirai et al., 2007), 2형 당뇨나 비만억제 효과(Horiba et al., 2010) 등이 알려진 naringenin chalcone, 항산화효과(Metodiewa et al., 1997), 혈액응집억 제(Navarro-Núñez et al., 2008), 천식억제작용(Jung et al., 2007) 등이 알려진 quercetin-3-rutinoside 등 생리활성 플라 보노이드가 다량 함유되어 있음이 밝혀졌다.

방울토마토 Betatini 품종 메탄올 추출물에 함유된 폴리 페놀 화합물과 플라보노이드 함량은 Table 1과 같다. 방울 토마토 건조물 1 g 당 폴리페놀은 11.02±1.98 mg, 플라보노 이드는 4.53±0.59 mg이 포함되어 있었다. Na et al.(2013)은 국내 재배지역별 일반 토마토에 원물 중량(fresh weight) 100 g 당 폴리페놀과 플라보노이드가 각각 19.43–32.44 mg, 6.56–10.93 mg이 함유되어 있다고 보고하였다. 일반 토마토 의 수분함량이 약 90%임을 고려하면 방울토마토 Betatini 품종에 포함된 폴리페놀 함량은 일반 토마토에 포함된 폴 리페놀 함량의 평균값과 유사하였다. 반면 플라보노이드 함 량은 일반토마토에 비해 4배 이상 높음을 알 수 있었다. 일 반토마토와 방울토마토의 함량 차이를 정확히 비교하기 위 해서는 좀더 많은 품종의 방울토마토의 폴리페놀과 플라보 노이드 함량을 분석하는 것이 필요할 것으로 사료된다.

방울토마토 Betatini 품종 추출물의 항산화 활성을 알아 보기 위해 DPPH radical scavenging activity(DSA), ABTS radical scavenging activity(ASA) 및 Ferric reducing antioxidant power(FRAP)를 측정하였다.

DSA와 ASA는 각각 DPPH와 ABTS에 의해 생성되는 free radical에 전자를 공여하여 제거함으로써 산화를 억제 하는 능력을 측정하는 방법으로 비교적 측정 방법이 간단 하고 짧은 시간내 측정이 가능하여 항산화활성을 측정하는 데 널리 사용되는 방법이다. FRAP는 항산화 능력이 있는 물질이 대부분 환원력을 가지고 있다는 사실을 바탕으로 Fe³⁺을 Fe²⁺으로 환원시키는 능력을 측정함으로써 항산화활 성을 측정하는 방법이다(Benzie & Strain, 1996). 방울토마 토 Betatini 품종 메탄올 추출물을 농도별로 희석하여 DSA와 ASA를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. DSA를 측정 하기 위해 추출물을 50, 100, 250, 500 μg/mL 농도로 처리 하였을 때 각각 4.62±1.51, 11.76±1.68, 42.29±0.56, 71.89± 0.93%의 DPPH 라디칼 소거활성을 보였으며 처리 농도가 증가함에 따라 유의적으로 소거활성이 증가함을 알 수 있었 다. 또한, 추출물을 50, 100, 250, 500 μg/mL 농도로 조절하 여 ASA를 측정한 결과 각각 9.01±0.39, 17.61±0.67, 39.90±0.66, 68.08±1.65%의 ABTS 라디칼 소거활성을 보여 처리 농도가 높아짐에 따라 유의적으로 활성이 증가하였다.

Fig. 1. Antioxidative activities of the Betatini cultivar of cherry tomato. (A): DPPH radical scavenging activity (DSA), (B): ABTS radical scavenging activity (ASA) Bars with different superscripts indicate significant differences at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.

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항산화활성의 정도를 정량화하기 위하여 DPPH와 ABTS 에 의해 생성되는 free radical을 50% 소거시키는 추출물 의 농도를 IC₅₀으로 정의하여 산출하였으며 FRAP 값은 추 출물 1 g 당 생성하는 Fe²⁺의 양을 측정하였다(Table 2).

DPPH 방법에 의한 항산화 활성을 측정한 결과 추출물 의 IC₅₀은 340.26±4.28 μg/mL이었다. 또한, ABTS 방법에 의해 항산화 활성을 측정한 결과 추출물의 IC₅₀은 350.77±7.79 μg/mL로 나타나 라디칼 소거능력을 측정하는 두가지 방법에서는 거의 유사한 결과를 얻을 수 있었다. FRAP를 측정한 결과 추출물 1 g 당 25.47±0.79 μmol Fe²⁺ 를 생성함을 알 수 있었다. 이와 같은 결과를 통해 방울토 마토 Betatini 품종은 항산화 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

Choi et al.(2011)은 국내에서 재배된 11종 일반 토마토 의 항산화활성을 측정한 결과 DPPH 방법에 의한 IC₅₀이 145–496 μg/mL, FRAP 값이 12–45 μmol Fe²⁺/g라고 보고 하였는데 이는 방울토마토 Betatini 품종 추출물의 IC₅₀과 유사하였다. 또한, Morales-Soto et al.(2014)은 44종의 스 페인산 과일과 채소의 항산화활성을 비교한 연구에서 일반 토마토의 FRAP 값이 29.1–67.2 μmol Fe²⁺/g 이라고 보고 하였는데 방울토마토 Betatini 품종 추출물의 FRAP 값에 비해 약간 높은 값이었다. 일반 토마토와 방울토마토의 항 산화활성을 좀더 정확하게 비교하기 위해서는 국내에서 재 배되는 더 많은 품종의 방울토마토에 대한 항산화활성 검 증이 필요하리라고 판단된다.

방울토마토 Betatini 품종 추출물이 정상 간세포(Chang), 정상 폐세포(Hel299), 폐암세포(A549), 자궁경부암세포 (HeLa) 및 간암세포(HepG2)의 생육에 미치는 영향을 알아 본 결과는 Fig. 2와 같다. 그리고 각 세포의 생육을 50% 억제하는 추출물의 농도인 IC₅₀을 산정하여 Table 3에 나 타내었다.

Fig. 2. Inhibitory effects of the Betatini cultivar of cherry tomato against normal liver cell (Chang), normal lung cell (Hel299), lung cancer cell (A549), cervical cancer cell (HeLa) and liver cancer cell (HepG2). Bars with different superscripts indicate significant differences at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.

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방울토마토 Betatini 추출물을 10, 50, 100, 250, 500 μg/ mL로 농도별로 각 세포에 처리한 결과 정상 간세포 (Chang)에서는 유의적인 생육 저해나 증가 효과가 나타나 지 않았고 정상 폐세포(Hel299)는 500 μg/mL의 고농도로 처리하였을 경우 약하게 생육이 저해 되었다. 또한, 폐암세 포인 A549에 추출물을 처리하였을 경우에도 정상 폐세포 의 경우와 유사하게 500 μg/mL의 고농도로 처리하였을 경 우 약한 생육저해 효과가 관찰되어 추출물은 정상 폐세포 와 폐암세포 모두에 약한 생육 저해 효과를 보임을 알 수 있었다. 추출물의 Hel299 및 A549에 대한 생육저해 효과 가 최대 처리 농도인 500 μg/mL에서 각각 18.56%, 20.36% 로 낮아 IC₅₀ 은 산정할 수 없었다. Choi et al.(2011)은 일 반 토마토 추출물이 폐암세포(A549)에 약한 저해 효과가 있다고 보고하여 본 연구의 결과와 유사하였다.

추출물을 자궁경부암세포(HeLa)에 처리하였을 경우 처리 농도에 따라 유의하게 세포의 생육이 억제되어 250 μg/mL, 500 μg/mL를 처리하였을 때 각각 41.78%, 71.6%의 높은 생육억제 효과를 보였고 HeLa 세포에 대한 추출물의 IC₅₀ 은 326.24±16.83 μg/mL로 산정되었다. 선행연구 결과를 살 펴보면 토마토 음료 제조의 부산물인 토마토 박(tomato waste) 추출물을 25 mg/mL 농도로 처리하였을 경우 HeLa 세포의 생육이 80% 이상 저해되었고(Cetkovic et al., 2012) 토마토의 glycoalkaloid를 분리하여 처리하였을 경우 1 μg/mL이하의 낮은 농도에서 HeLa 세포의 생육이 거의 100% 저해되었다는 보고(Choi et al., 2010)가 있어 방울토 마토 Betatini 추출물이 HeLa 세포에 대해 강한 저해 활성 을 갖는다는 본 연구의 결과와 일치함을 알 수 있었다.

간암세포(HepG2)의 생육에 미치는 추출물의 영향을 알 아본 결과 250 μg/mL, 500 μg/mL를 처리하였을 때 각각 42.82%, 56.46%의 생육억제 효과를 보였다. HepG2 세포에 대한 추출물의 IC₅₀은 385.13±24.60 μg/mL이었다. Friedman et al.(2009)의 연구에서는 일반 토마토 9종의 메탄올 추출 물 중 glycoalkaloid 분획물이 HepG2 세포에 강한 생육저 해 효과가 있음이 밝혀졌는데 이는 방울토마토 Betatini 품 종 메탄올 추출물이 HepG2 세포에 억제 활성을 갖는다는 본 연구와 유사하였다.방울토마토 Betatini 품종 추출물이 정상세포와 암세포의 생육에 미치는 영향을 알아본 결과 정상 간세포(Chang)의 생육에는 거의 영향이 없었으나 자궁경부암세포(HeLa)와 간암세포(HepG2)에 대해서 일반 토마토와 유사하게 상당 한 저해 활성이 있음을 확인하였다. 이는 방울토마토 Betatini 품종이 특정암에 대해 효과적인 항암식품이 될 수 있음을 시사한다고 할 수 있다. 물론, 항암식품으로서의 가 치를 정확하게 규명하기 위해서는 더 많은 암세포에 대한 억제 효과와 방울토마토의 섭취 빈도와 암 발생 위험도간 의 상관관계에 대한 장기적인 역학적 연구(epidemiological study)가 필요하다. 일반 토마토의 경우섭취 빈도가 높을수 록 전립선암, 폐암, 유방암 등 다양한 암의 발생위험을 낮 추며(Mayne et al., 1994; Giovannucci et al., 1995; Agudo et al., 1997; Giovannucci, 1999; Barber & Barber, 2002; Hwang & Bowen, 2004 ; Polozza et al., 2011) 치료 중인 폐암 환자들의 생존율을 높이는(Goodman et al., 1992) 등 많은 연구결과가 축척되어 있어 항암식품으로서의 가치가 규명되었으나 방울토마토에 대한 역학적인 연구는 찾아 볼 수 없으므로 방울토마토 Betatini 품종의 항암식품으로서의 활용성을 알아보기 위해서는 좀더 많은 연구가 필요할 것 으로 사료된다.