삼지구엽초의 인체 대장암세포 HCT116 사멸 효과

실험에 사용한 북한산 삼지구엽초는 2011년 평양시내 재래시장에서 구입한 것을 사용하였다. 건조된 시료(22 g) 를 70% ethyl alcohol로 90℃ water bath에서 1시간 동안 2회 추출하고, 추출액은 여과지(Whatman No. 1, Cambridge, UK)와 초원심분리기(Sorvall, Dupont Instruments, Wilminton, DE, USA)를 사용하여 여과하였다. 여과된 추출 액을 rotary vacuum evaporator(Eyela, Tokyo, Japan)로 감압 농축 후 -80℃에서 동결건조(Operon, Kyunggi-do, Korea)시 켜 분말시료(수득률 5.431 g)를 제조하여 마쇄한 후 3차 증 류수에 녹여 사용하였다(Ryu et al., 2013a). 시료에 함유된 주요 화합물인 icariin(Kim et al., 2008, Fig. 1)은 3차 증류 수에 완전히 용해시킨 후 실험에 사용하였다.

Fig. 1. Chemical structure of Icariin isolated from Epimedium koreanum Nakai.

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인체 대장암 세포주인 HCT116 세포는 Korea Cell Line Bank(Seoul, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 분주 받은 세포주를 10% heat-inactivated FBS와 1% penicillinstreptomycin을 첨가한 RPMI-1640 배지를 사용하여 5% CO₂를 함유한 37℃ 배양기(Sanyo Electric Co. Ltd., Gunma, Japan)에서 키우고, 2주 이상 계대 배양하여 배양 환경에 충분히 적응시킨 후 세포밀도가 70-80% 정도로 포 화되면 0.05% Trypsin-EDTA 용액을 사용하여 계대 배양하 면서 실험에 사용하였다.

농도별 시료 처리에 의한 HCT116 대장암 세포의 증식 정도는 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay로 측정하였다. 먼저 HCT116 대장암 세포를 96 well plate에 1.5×10⁴ cells/mL 밀도가 되도록 분주하여 24시간 배양한 후 시료를 농도별로 처리하였다. 배양한 후에 MTT 시약을 2.0 mg/mL 농도로 50 μL를 각 well에 처리하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, 배지 를 제거한 후 dimethyl sulfoxide를 넣어 형성된 formazan 크리스탈을 용해시켜 540 nm에서 microplate reader(Bio- Rad, Hercules, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다. 세포의 증식률은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율 로 나타내었다(Ryu et al., 2013a).

세포 사멸과 증식에 관련된 여러 단백질의 발현을 western blot analysis를 실시하여 확인하였다. HCT116 세 포를 1×10⁶ cells/mL의 농도로 6 well plate에 분주하고 시 료를 농도별로 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 sample을 모았다. Sample를 모을 때에는 차가운 PBS로 세척한 후 cell을 모아 2,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, protein lysis buffer를 넣어 세포를 파괴하고, 4℃, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 모아 시료로 사용하였다. 이 어서 단백질 정량 후 12% gradient sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)에서 동량의 단백질을 loading하여 2시간 동안 단백질을 분리한 후, nitrocellulose membrane에 옮겼다. 단백질이 옮겨진 membrane에 1% BSA로 bocking을 한 후, 1차 antibody인 Bcl-2와 Bax(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA), cleaved caspase-3, cleaved-9, cleaved PARP(Cell Signaling Technology Inc., MA, USA)를 4℃, overnight으로 반응시켰다. 그리고 TBST로 세척한 후, 다시 2차 goat anti-rabbit IgGHRP( Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA), goat antimouse IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA), rabbit anti-goat(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA)로 1시간 동안 반응시켜 TBST로 씻어낸 후, ECL solution으로 확인하였다(Ryu et al, 2014).

실험 결과는 SPSS 12.0 프로그램을 이용하여 각 실험 군 의 평균과 표준편차로 계산하고 ANOVA 분석 후 p < 0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하여 대조군과 처리군 간의 유의성을 검증하였다.

MTT assay는 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT가 불용성의 보라색 formazan 으로 환원되는 원리를 이용한 방법이다(Ryu et al., 2011). Noh 등은 삼지구엽초 추출물을 Hep3B(간암 세포), A549(폐 암 세포), MCF7(유방암 세포)에 처리했을 때 높은 암세포 증식 억제 효과가 있음을 보고(Noh et al., 2003)한 바 있다.

본 실험에서는 삼지구엽초를 70% 에탄올로 추출물을 제 조하고, 동결건조 후 3차 증류수로 희석한 추출물을 인체 대장암 세포주인 HCT116에 0, 0.5, 1.0, 2.0 mg/mL 농도 별로 첨가하여 세포의 증식억제 정도를 측정한 결과, 대장 암 세포 생존율이 77.0%, 59.3% 및 33.8%를 나타내었다. 실험 결과, 시료의 농도가 증가할수록 대장암 세포주인 HCT116의 증식 억제효과가 증가하는 것이 확인되었다 (Fig. 2). 본 시료를 70% ethyl alcohol로 추출한 후 주요 flavonol glycosides를 분석한 결과, Icariin 0.69%, Epimedin B 0.14%, Epimedin C가 0.06% 각각 함유되어 있는 것으 로 확인되었으므로(Ryu et al., 2013a), 함량이 가장 높은 Icariin 화합물의 HCT116 세포에서의 활성을 확인하였다. 단일 화합물인 Icariin을 0, 10, 40, 60 M 농도별로 처리하 여 대장암 세포 생존율을 확인한 결과, HCT116 세포 생존 율이 각각 64.2%, 57.6% 및 49.2%로 확인되었다(Fig. 3).

Fig. 2. Effect of Epimedium koreanum Nakai on cell viability on HCT116 cell. HCT116 cell was plated in 96 well plates at 1.5×10⁴ cells/well in RPMI-1640 supplemented with 10% FBS. The cells were treated with Epimedium koreanum Nakai extracts (0.5, 1.0, 2.0 mg/mL). Cell viability was estimated by MTT assay. *p <0.05, significantly different from control treatment on Epimedium koreanum Nakai in HCT116 cells.

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Fig. 3. Effect of Icariin isolated from Epimedium koreanum Nakai on cell viability on HCT116 cell. HCT116 cell was plated in 96 well plates at 1.5×10⁴ cells/well in RPMI-1640 supplemented with 10% FBS. The cell was treated with Icariin (10, 40, 60 μM). Cell viability was estimated by MTT assay. *p < 0.05, significantly different from control treatment on Icariin in HCT116 cells.

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세포사멸이 일어나기 위해 관여되는 중요한 인자인 Bcl- 2, Bax, caspases의 발현에 대한 시료의 효능을 단백질 수 준에서 관찰하기 위한 실험을 수행하였다. HCT116 대장암 세포에 평양 시내 재래시장에서 구입한 삼지구엽초 70% ethyl alcohol 추출물을 처리한 후 세포를 배양하여 total cell lysate를 제조한 후 western blot analysis를 시행하였다. 실험 결과, 세포 생존 조절에 관여하는 것으로 알려진 Bcl-2의 발현이 감소하였고, 미토콘드리아 막의 투과성과 cytochrome c의 방출을 증가시켜 apoptosis를 유도하는 Bax의 발현은 증가하는 것으로 확인되었다(Fig. 4).

Fig. 4. Effect of Epimedium koreanum Nakai produced on expression of Bcl-2 and Bax, cleaved caspase-3, cleaved caspase- 9, pro-caspase-3 and cleaved PARP in HCT116 cells. HCT116 cells (1×10⁶ cells/mL) were seeded onto culture dish and treated with the indicated concentrations of Epimedium koreanum Nakai for 24 hr. Subsequently, 30 μg of cell extract protein isolated from Epimedium koreanum Nakai treated HCT116 cell was subjected to SDS-PAGE in 12% polyacrylamide gels, transferred to PVDF membranes with antibodies against the proteins of interest.

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암세포의 사멸을 유도하는 효능 성분들은 Bcl-2 family 단백질의 변화를 초래하여 미토콘드리아 막의 투과성을 증 가시켜 세포사멸을 유도한다고 보고(Jung et al., 2006)되고 있으며, 본 실험에서 Bcl-2 및 Bax의 발현이 변화되는 것 을 통해, 북한산 삼지구엽초 추출물이 HCT116 세포의 세 포사멸 유도기전에 관여하는 것으로 설명될 수 있다.

세포사멸은 외적경로인 cell death receptor와 내적경로인 미토콘드리아에 의해 유도되며(Jin et al., 2005), cell death receptor에 의한 세포사멸은 caspase-8과 결합하여 활성화하 여 세포사멸을 유도하며, 미토콘드리아를 통한 내적 경로 는 Apaf-1과 함께 caspase-9을 활성화시켜 세포사멸을 유 도한다(Green et al., 1998). 따라서 본 실험에서 cleaved caspase-3와 cleaved caspase-9의 밴드가 증가한 것을 통해, 북한산 삼지구엽초 추출물에 의한 세포사멸 기전이 미토콘 드리아의 내적 경로에 의해 시작됨을 제시하고 있다. 또한 caspase-3의 주요한 표적 단백질인 PARP의 밴드도 증가하 였는데 이는 caspase-3에 의해 세포 분해가 촉진되면서 PARP가 증가하여 세포가 사멸(Oliver et al., 1998)되었음을 나타낸다. 이러한 현상은 미토콘드리아 막 투과성을 조절 하는 Bcl-2 family에 의해 cytochrome C 방출이 증가하면 서 apoptosis가 조절된다는 문헌(Koesmeyer et al., 1993)과 일치한 결과이다.

북한산 삼지구엽초 추출물에 의한 단백질 발현의 변화가 유전자 조절에 의한 것인지를 확인하기 위한 목적으로, 세 포사멸을 억제하는 유전자인 Bcl-2와 이와는 반대로, 세포 사멸을 유도하는 유전자인 Bax의 유전자 발현을 RT-PCR 방법에 의해 대조군인 β-actin과 비교 분석하였다.

실험 결과, 북한산 삼지구엽초 추출물을 시료 농도별로 HCT116 세포에 처리한 경우, anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2 의 mRNA 발현은 시료의 농도가 증가할수록 감소한 반면, pro-apoptotic 유전자인 Bax의 발현은 증가하였으며(Fig. 5), 이는 western blot analysis를 통해 확인된 사실(Fig. 4)과 일 치하는 결과이다.

Fig. 5. Effects of Epimedium koreanum Nakai produced on Bcl- 2 and Bax mRNA levels in HCT116 cells. HCT116 cells (1×10⁶ cells/mL) were seeded onto cell culture dish plate and treated with the indicated concentrations of Epimedium koreanum Nakai for 24 hr. Total RNA was then isolated, reverse transcribed and subjected to PCR with gene-specific primers. The PCR products of the genes were then subjected to electrophoresis in 1% agarose gels and visualized by staining with ethidium bromide. A typical results from three independent experiments is shown.

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세포가 산화 스트레스에 의해 DNA 손상을 받으면 p53 의 증가로 Bax의 발현이 높아지면서 세포사멸이 증가되고, 반대로 Bcl-2 발현 증가로 Bcl-2 homo-dimers의 평형이 기 울어 세포사멸이 억제되며, Bcl-2/Bax 비율이 50% 이하로 감소하면 세포사멸이 진행된다고 보고(Yang et al., 1995)된 바 있다. 본 연구팀은 북한산 삼지구엽초의 암 억제기전에 서 중요한 역할을 하는 p53 유전자에 의한 mRNA 변화를 인체 유방암 세포주인 MDA-MB-231에서 관찰한 결과, 48 시간대에서 세포사멸이 증가되는 것을 확인하였으며, 시료 에 함유된 주요 prenylated flavonol glycoside 화합물인 Icariin을 처리하는 경우, p53 및 Bax의 mRNA 발현을 증 가시키고, 반대로 Bcl-2 발현을 감소시키는 연구결과를 통 해, 이들 유전자가 유방암 세포주인 MDA-MB-231 사멸에 도 중요한 역할을 하는 사실을 규명(Ryu et al., 2013a)한 바 있다.