발효농산물로부터 분리한 사천지역특화 미생물의 다양성 및 특성연구

본 연구에 사용된 발효농산물은 사천 지역의 여러 가구의 전통 발효식품을 시료로 확보(Table 1)하였으며 시료의 오염 방지를 위해 위생 장갑을 착용한 후 멸균된 spatula를 사용하여 시료를 채취하였고, 이를 멸균된 50 mL 원추형 튜브에 담아 아이스박스에 보관하여 이동하였다. 실험실에 도착한 후, 실험이 진행되기 전까지 샘플은 4℃에서 보관하였다.

사천시 농협, 농장, 여러 가정집 등에서 모은 32개 발효된 농산물로부터 사천지역특화 호염성 미생물 분리를 위해 각각의 샘플 1 g을 멸균된 0.85% 식염수에 첨가하여 교반기로 교반하여 현탁하였다. 1 mL의 현탁 샘플을 사용해 10배 단위로 10^–1에서 10^–4까지 단계적으로 희석하였다. 이후 해양 미생물 전용배지인 marine agar (BD, USA)로 일반 배양배지를 준비하여 희석액을 도말하고, 37℃에서 호기성 호염 미생물을 배양하였다. 배양 후, 배지 상에 나타나는 균의 크기, 모양, 색상 등의 형태학적 특성을 관찰한 다음, 동일한 고체배지를 사용해 single colony isolation을 추가적으로 수행하였다. 순수하게 분리된 균주의 혼합배지 내 생육 가능성을 확인하기 위해 nutrient agar (BD, USA), R2A agar (BD, USA), 및 tryptic soy agar (BD, USA) 배지에 평판 도말법으로 37℃에서 7일간 고정 배양을 진행하였다. 또한, 분리된 미생물의 염 농도 및 pH 변화에 따른 생육 가능성을 확인하기 위해 marine agar (BD, USA) 고체배지를 제작하여 37℃에서 생육을 확인하였다. 마지막으로 배양 온도에 따른 생육 여부를 조사하기 위해 marine agar (BD, USA)를 이용하여 25, 30, 35, 40, 45℃에서 배양을 진행하였다(Jeong et al., 2021).

사천시 농협, 농장, 여러 가정집 등에서 모은 32개의 발효 농산물로부터 호기적 배양 조건으로 분리된 균주들의 분자 생물학적 동정을 위해 각각의 colony를 marine agar (BD, USA) 고체 배지에 배양하여 ㈜마크로젠에 16S rRNA 염기서열 분석을 의뢰하였다. 16S rRNA 유전자는 프라이머 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)와 1492R (CGGTTACCTTGTTACGACTT)을 사용하여 증폭되었다. 결과는 EzBioCloud의 웹사이트(http://www.ezbiocloud.net)에서 제공하는 public nucleotide databases에 있는 16S rRNA 유전자 DNA 염기서열과 비교 및 분석되었다. 계통발생학적 분석(phylogenetic analysis)은 MEGA (version 6) 소프트웨어 패키지에 내장된 Neighbour-joining (NJ) 방법을 이용하여 수행되었다(Lee et al., 2020a).

분리된 호염성 미생물의 세포외 분해 효소인 protease, amylase 및 lipase의 생산 능력을 확인하기 위해 각 효소와 특이적으로 반응하는 기질 성분을 포함한 고체 평판 선별 배지를 사용하였다. Protease 생산능 검증을 위해 20% skim milk (BD, USA)를, amylase는 0.2% soluble starch (BD, USA), lipase는 1% Tween 80 (BD, USA)를 기질로 선택하여 marine agar (BD, USA) 배지에 각각 첨가하여 배지를 제조하였다. 이후 분리된 균주를 배지에 접종하고 37℃에서 7일 동안 배양한 후 저지원(clear zone) 직경을 측정하여 분해 효소 활성을 평가하였다. 효소 활성 분해능은 배양 후 나타난 저지원의 크기에 따라 (+++: >7 mm, ++: >4∼6 mm, +: 1∼3 mm) (Table 4)로 기록하였다(Lee et al., 2020a).

분리된 균주의 auxin 생성 능력을 확인하기 위해 0.1% L-tryptophan (Sigma-Aldrich, USA)이 첨가된 marine broth (BD, USA) 배지에 분리된 순수 colony를 접종하고 37℃에서 5일간 배양하였다. 배양 후 Salkowski 시약(35% HClO₄ 50 mL+0.5 M FeCl₃ 1 mL) 800 μL를 배양 상등액 400 μL에 혼합하여 어두운 곳에서 30분 동안 반응시킨 뒤, 535 nm에서 흡광도를 측정하여 옥신 생성 활성을 평가하였다(+++: >1.0, ++: 0.5∼1.0, +: 0.3∼0.5) (Table 4) (Lee et al., 2020a).

사천시 농협, 농장, 여러 가정집 등에서 모은 32개 발효된 농산물로부터 식품 산업에 활용이 용이할 것으로 생각되는 호기적으로 생육 가능한 사천지역특화 호염성 미생물을 분리하고자 marine agar 배지에 시료를 희석, 도말하여 배양한 후, 배양된 colony의 모양, 색깔, 등 형태학적 특징을 육안으로 구분이 가능한 균주들을 대상으로 동일한 고체배지를 사용하여 2차로 단일 균주 분리를 수행하였다. 그 결과 Table 2에서 나타낸 것처럼 사천지역 장류 시료로부터 86균주와 비장류(장아찌, 과실청 등) 시료로부터 42균주를 분리하여 호염성 미생물 총 128균주를 순수 분리하였다. 또한 주요 성분이 무기염으로 이루어진 marine agar 배지는 해양환경의 호염성 미생물 배양에 유리한 배지이기에 산업적 활용가능성을 확인하기 위하여 대량 배양 등에 많이 활용되는 혼합배지(NA, Nutrient Agar; R2A, Reasoner’s 2A agar; TSA, Tryptic Soy Agar)에서 분리된 균주의 생장능력을 확인한 결과 128균주 중 모든 균주(weak growth 포함)가 적어도 1종류 이상의 산업용 혼합 배지에서 생장이 가능한 것을 확인하였다. 이는 사천지역 발효농산물 시료로부터 천연식물 발효용 halophiles 탐색에 있어서 분리 배지 성분 영향이 어느 정도 미치는 것으로 생각되며, 본 연구 결과를 바탕으로 사천지역 발효농산물 시료로부터 halophiles 분리 최적 배지는 MA (marine agar) 배지로 나타났다. 또한 분리된 균주의 최적 생육 pH를 조사하기 위해 pH 5, 7, 9로 각 조절한 MA 배지에 균주들의 생육을 확인하였다. 산다래수액간장(pH 1, Table 1)으로부터 분리된 JS-65-9를 제외한 127균주가 pH 7에서 생장이 가능(weak growth 포함)하였으며 JS-65-9를 포함한 117균주는 pH 4에서도 생장이 가능(weak growth 포함)하였다(Table 2). 김치, 막걸리, 청국장과 같은 개별 발효식품에서 미생물을 분리 · 동정하는 연구가 다수 수행되었으나, 특정 지역 내 다양한 발효식품에서 분리된 미생물의 분포와 특성을 비교 · 분석하는 연구는 제한적이었다. 최근 순창, 제주, 사천과 같은 지역에서 지역 특화 미생물을 분리 · 동정하고 이를 산업적으로 활용하려는 노력이 활발히 진행되고 있다. 순창의 경우 전통 고추장, 된장, 간장 등의 발효 과정에서 중요한 역할을 하는 미생물들을 집중적으로 연구(Lee et al., 2014)하고 있으며, 2024 발효미생물산업클러스터고도화사업에서 발효 과정의 심화단계 연구를 집중하여 산업화에 적용하고 있다. 반면, 제주에서는 지역의 독특한 환경적 요인(화산토양, 해양 환경 등)이 미생물 다양성에 미치는 영향을 고려하여 미생물을 탐색 · 채집하고, 이를 체계적으로 정리한 '제주토착미생물도감'을 발간(3권)하는 등의 연구를 수행하였다.

이에 반해 사천시미생물발효재단은 순창과 제주 연구의 장점을 결합하여, 사천 지역 내 다양한 발효식품에서 미생물을 분리 · 동정하는 것뿐만 아니라, 산업적 응용 가능성을 고려한 특성 분석을 강조하였다. 이러한 연구를 통해 사천 지역에서 다양한 배지 이용성과 세포외 효소활성을 포함한 산업적 응용성이 높은 128 균주를 확보할 수 있었다. 이는 지역 기반의 미생물 자원을 산업적으로 활용하는 데 있어 중요한 성과로 볼 수 있다.

사천시 발효농산물 시료로부터 호기적으로 분리된 128 균주의 16S rRNA 유전자 DNA 염기서열을 기반으로 EzBioCloud를 통해 미생물 동정을 실시하였다. 크게 3문 4강 5목 8과 13속 33종으로 나타났으며(Table 3), 분리 · 동정된 균주, 근연 균주 및 그들의 상동성을 Table 4에 나타내었다. 또한 분리 동정된 균주들 간의 유연관계를 확인하기 위하여 16S rRNA 유전자 DNA 염기서열 계통수를 작성하였다(Fig. 1). Table 3에서 보는 바와 같이 Bacillota (Bacilli)가 96.9%로 우점도가 높았다. 가장 우점도가 높은 Bacillota 문은 Bacillaceae 88.3%, Caryophanaceae 3.9%, Staphylococcaceae 3.1%, Paenibacillaceae 0.8%, Planococcaceae가 0.8%로 구성되었으며, 총 5과 9속 29종이 분리되었다. 본 연구에서 가장 높은 비율로 분리된 Bacillaceae 과 중에서 Bacillus 속은 해양생물과 담수생물에서 많이 분리되며 여러 전통적 발효식품 중에서도 발효농산물과 젓갈류에서 많이 분리된다는 것이 알려져 있다. 이에 복잡한 리아스식 해안을 포함한 다양한 해양환경을 접해 있는 사천시 내의 발효농산물 시료에서 Bacillaceae 과가 가장 많이 분리된 것으로 판단되며(Kim et al., 2013; Ryu et al., 2017; Park et al., 2020), 실제로 사천시 32개 발효농산물 시료 중에 비장류(장아찌, 과실청 등)보다는 장류에서 Bacillaceae과의 호염성 미생물들이 매우 많이 분리되었다. 이는 장류의 발효환경이 고염도인 것이 큰 원인일 것이며, Bacillus와 같은 균주들은 pH 조절과 항균 능력이 우수하여 이와 같은 발효환경에서 많이 발견되는 것이다(Kim et al., 2010; Kim et al., 2013).