고압 Hormesis가 블루베리의 테로스틸벤 함량과 생물활성에 미치는 영향

본 연구에서는 일산 지역에서 2014년 7월에 수확한 브 리지따(Brigitta) 품종의 블루베리(Vaccinium spp.)가 사용되 었다. 수확 직후 고압 처리를 한 블루베리는 과피와 과육 을 분리하였고, 과피만을 동결건조하여 분석에 사용하였다. 실험에 사용한 모든 시약은 HPLC grade를 사용하였고, JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA)와 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 표준물질로 사용한 테 로스틸벤은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

수확 직후의 블루베리를 0.05 mm 두께의 polyethylene bag에 담은 후 세포조직이 거의 손상되지 않을 정도로 진 공 밀봉하여 초고압 장치(TFS-10L, Toyo Koatsu Co. Ltd., Hiroshima, Japan)에 투입한 후 압력처리를 실시했다. Fig. 1은 식품고압장치의 개략적인 구조도를 나타낸 것으로 압 력관, 압력 조절장치, 온도조절장치로 구성되어 있다. 밀봉 된 시료를 압력관에 넣고 처리 조건(압력, 온도, 시간)을 설정하면, 압력조절장치와 온도조절장치에 의해 압력관 내 의 온도와 압력이 설정 조건으로 맞추어지고, 그 다음 처 리 시간 동안 압력과 온도가 유지된 후 처리 시간이 끝나 는 즉시 압력이 해제되었다. 본 실험에서는 25°C에서 5분 간 2, 10, 20MPa로 압력 조건을 다르게 하여 처리하였다.

Fig. 1. Schematic diagram of high pressure system. 1: vessel, 2: oil return system, 3: pump, 4: solenoid value, 5: booster pump, 6: solenoid value, 7: solenoid value, 8: pilot check, 9: drain valve, 10: safety sensor, 11: relief value, 12: solenoid value, 13: level sensor, 14: solenoid value, 15: safety value, 16: drain pipe (Kim, 2009).

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고압 처리에 따른 테로스틸벤의 정량적 변화를 분석하기 위해 Määttä-Riihinen et al. (2004)의 방법과 Jeandet et al. (1997)의 방법을 수정하여 스틸벤을 추출한 후 HPLC법으 로 분석하였다. 즉, 동결건조된 블루베리 과피를 믹서기로 분쇄하였다. 분쇄된 시료 3 g에 25 mL의 에틸아세테이트를 가하여 현탁시킨 후 초음파 처리기(5210R-DTH, Branson Ultrasonics Co., Danbury, CT, USA)로 30분간 처리하여 추출하였다. 추출액을 원심분리장치(Centrikon T-324, Kontron, Milano, Italy)를 사용하여 10분간 12,000×g로 원심 분리한 후 여과하였고, 잔여물을 수거하여 같은 방법으로 재추출하였다. 여과액을 혼합한 후 감압농축기(Rotavapor R-210, Buchi, Flawil, Switzerland)를 사용하여 40°C에서 농축하였고, 농축물을 1 mL의 메탄올에 녹여 0.22 μm syringe filter로 여과한 후 HPLC에 주입하였다.

블루베리 과피 추출물에 함유되어 있는 테로스틸벤을 HPLC법에 의해 정량하였다. HPLC 시스템(Agilent 1100 series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)은 펌 프, 인젝트, 형광검출기, 적분기(Chemstation software), 컬 럼(Agilent Eclipse XDB-C18: 4.6 mm × 250 mm, 5 μm, ZORBAX) 등으로 구성되었으며, 분석 조건은 다음과 같다. Water (A)/acetonitrile (B)를 용매로 하여 gradient 조건 하 에서 1.0 mL/min의 유동속도로 40분간 작동시켰다. 이때 시료 주입량은 20 μL이었고, 용매의 gradient 조건은 초기 90:10의 A/B 비율로 시작하여 18분까지 15:85, 23분까지 15:85 비율로 유지한 후 30분까지 90:10으로 조정되었으며, 마지막으로 10분 동안 90:10으로 유지하였다. 검출파장은 형광검출기의 여기파장 330 nm, 측정파장 374 nm에서 측 정되었고, 분석 컬럼의 오븐 온도는 25°C로 일정하게 하였 다. 각 실험값은 3회 반복하여 측정한 후 평균으로 표시하 였다.

블루베리 과피 시료의 생물활성은 Hong et al. (2012)의 방법에 의해 해독화 효소 발현 조절 능력을 평가하였다. 분말화된 블루베리 시료를 100 mg/mL로 10% DMSO in PBS 용액에 녹여 -20°C 냉동고에 보관 후 실험시 희석하 여 사용하였고, 해독화 효소 발현 조절 능력은 quinone reductase (QR) 유도활성 측정을 통해 평가되었다. 마우스 간암 세포주인 Hepa 1c1c7 세포를 배양, 처리한 후 lysis 하여 효소용액을 첨가하여 반응시킨 후 단백질 양을 crystal violet 염색방법으로 정량하여 시험군 처리에 따른 QR 유도활성을 측정하였다.

테로스틸벤 함량 변화의 경우 Windows용 SAS 8.0 version (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, p<0.05 수준에서 Duncan의 multiple range test로 유의성을 검정하였다. 생물 활성 평가의 경우 ANOVA multi t-test (JAVA, Bonferroni Ver II)로 같은 수준에서 유의성을 판정하였다.

물리적 처리를 통한 호머시스 연구가 지속적으로 보고되 고 있지만 주로 자외선 처리에 의한 연구가 대부분이다. 국내에서는 자외선 조사에 의한 기능성 증폭에 대한 연구 를 Cho et al. (2008, 2011, 2012)이 수행하였으며, UV-A 와 UV-C를 이용하여 수확 직후의 과실에 자극을 주었을 때 딸기의 경우 펠라고닌(pelargonin)과 시아닌(cyanine)의 함량이 증가하는 경향을 보였고, 포도의 경우 레스베라트 롤(resveratrol) 함량을 최대 5배 이상 증폭할 수 있었다고 보고하였다.

본 연구에서는 수확된 블루베리의 대사를 조절하기 위해 3가지 수준의 압력 즉, 2, 10, 20MPa를 가한 후, 압력 처 리에 따른 테로스틸벤 함량 변화를 알아보기 위하여 HPLC 분석법을 사용하여 해당 물질의 함량을 정량분석 하였다. Table 1은 블루베리를 고압처리했을 때 압력 수준 에 따른 테로스틸벤 함량의 변화를 나타낸 것이다. 블루베 리에 압력을 처리하기 전에는 테로스틸벤의 함량이 0.25±0.03 μg/g이었으나, 고압 처리 후 0.33±0.05 μg/g까지 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 즉, 10 MPa 이하로 처리 하였을 경우에 테로스틸벤의 함량이 약 33% 증가되어 대 조구 대비 1.33배의 함량을 얻을 수 있었다. Pombo et al. (2011)은 UV 등과 같은 물리적 처리로 과실을 자극했을 때 2차 대사산물의 생합성 경로인 phenylpropanoid pathway 에 관여하는 첫 번째 효소인 PAL의 유전자 발현이 증가됨 으로써 과실 내 페놀류의 함량이 증폭되는 호머시스 효과 를 얻을 수 있었다고 보고한 바 있다. 테로스틸벤 또한 2 차 대사산물 중 하나로, 낮은 수준의 압력 처리에 의해 생 합성 효소의 유전자 발현이 유도되어 생성율이 향상되었을 가능성이 있다. 따라서 향후 고압처리에 의한 테로스틸벤 함량 변화와 관련 유전자의 발현 양상을 분석함으로써 고 압 호머시스 기작에 대한 규명이 필요할 것으로 판단된다.

블루베리는 대표적인 생리활성물질로서 flavonoid 계열의 색소인 anthocyanin을 함유하고 있으며 이의 항암 기작으 로 QR 등의 phase II 효소 활성 변화에 대한 많은 보고가 이루어져 있다(Srivastava et al., 2007; Dulebohn et al. 2008). 특히 Hong et al. (2012)은 자외선 호머시스에 의해 기능성 성분이 증폭된 딸기에서 QR 유도활성 등의 생물활 성이 향상되는 것을 확인함으로써 과실의 숙성 조절, 저장 성 향상 등에 대한 기존의 호머시스 효과뿐만 아니라 건강 기능성이 증대되는 효과 또한 가능하다는 Cho et al. (2008)의 연구를 뒷받침하였다. 따라서 본 연구에서는 고압 호머시스에 대한 기초 연구로서 블루베리에 대한 고압 효 과를 분석하기 위하여 일차적으로 발암과정 억제에 관여하 는 해독화 효소인 QR 발현 유도 효능을 평가하였다.

Fig. 2는 낮은 수준의 압력을 처리한 블루베리의 QR activity를 분석한 결과를 나타낸 것이며, 대조구 및 압력 무 처리 블루베리와 비교하였고, 양성 대조군으로는 QR 유도 활성이 있다고 알려진 β-naphthoflavone (BNF) 2 μM을 사 용하였다. Hapa 1c1c7 cells에 시료 1 mg/mL과 5 mg/mL의 두 가지 농도로 처리한 다음 QR 유도활성을 측정한 결과, 전체적으로 압력을 처리한 블루베리에서 압력 처리하지 않 았을 때보다 높은 유도효과를 나타내었다. 따라서 본 연구 에서는 블루베리의 유용 성분 증폭 및 생리활성 증대에 있 어서 고압처리의 활용 가능성을 최초로 확인한 바, 향후 고 압 호머시스에 관한 연구의 기초 데이터로서 가치가 있다고 판단된다.

Fig. 2. Quinone reductase activity of blueberry peels after high pressure treatment. ^*Mean is significantly different at p<0.05. Mean is significantly different as compared to CTL at p<0.05.

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