서 론
제주도는 남해에 위치한 화산섬으로 국내에서는 가장 큰 섬이며 온대 기후에 속해 겨울에도 거의 영하로 떨어지지 않고 영상을 유지하는 기후학적 특성을 가지고 있으며 사 면이 바다로 둘러싸여 있어 내륙 지역과는 다른 환경이 조 성되어 있다고 할 수 있다. 또한 제주도는 2002년 유네스 코가 기후 및 생물 다양성의 생태계적 가치를 인정하여 제 주도를 생물권보전지역으로 지정하였으며 이에 다양한 동 식물자원의 탐색 관련 연구는 지속적으로 이루어지고 있으 나(KFRI, 2014) 나고야 의정서의 발효로 인한 국내 미생 물 자원의 산업분야에의 활용가능성을 높이기 위한 국내 제주도 유래 미생물 자원의 탐색에 관한 연구는 미비한 실 정이나 최근 제주도 곶자왈과 같은 산림지역 토양이나 해 양 시료로부터 미생물의 다양성 및 특성 분석 연구가 조금 씩 이루어 지고 있다(Choi et al., 2016;Kim et al., 2017;Han et al., 2019).
높은 염 농도에서 생육이 가능한 호염성 미생물은 염분 함량이 높은 다양한 자연환경에서 유래하는 경우가 많으며 이러한 미생물들의 분리 및 동정을 통한 계통학적 다양성 관련 연구에 이용될 뿐만 아니라 염장 식품의 풍미 증가와 향미 발달, 육질 분해 등을 위한 protease를 생성하는 미생 물의 특성 규명 관련 연구에도 활용되고 있다(Giyatmi & Irianto, 2017;Park et al., 2017;Zang et al., 2020). 또한 호염성 미생물들이 생산하는 가수분해 효소 중 단백질가수 분해효소의 경우 식품, 세제, 섬유 펄프와 피혁 공업, 의약 품 생산과 같은 산업용 효소시장에서 높은 비율로 사용되 고 있으며 수산물 처리시에 발생하는 부산물과 같은 폐기 물의 처리 및 재활용 등 다양한 산업분야에 응용되고 있다 (Singh et al., 2016).
또한, 옥신은 줄기 끝의 분열 조직과 어린 잎에서 생성 되며 발아 중인 종자에서 생합성된다. 식물 생장과 관련된 세포의 분열을 촉진하고 세포벽을 신장시키는 역할을 하며 가장 많이 발견되는 옥신은 indole acetic acid (IAA)이다. 이 러한 옥신을 생성하는 미생물로는 Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium 등이 알려져 있다(So et al., 2009).
본 연구에서는 제주도 남쪽 해안에 위치한 대포포구와 화순항 주변의 토양으로부터 호기적으로 호염성 세균의 순 수 분리 가능성을 검증하고 다양한 산업에 응용 가능성이 있을 것으로 생각되는 가수분해효소 3종(amylase, lipase, protease)의 활성 유무을 탐색하였으며, 추가적으로 농업 분 야에서 식물의 생육을 증진시키는 기능을 하는 것으로 알 려져 있는 옥신(auxin) 생산능의 평가를 수행하여 일반적으 로 많이 사용되고 있는 화학비료를 대체할 수 있는 친환경 미생물제제 개발 기술을 위한 미생물 균주로써의 사용 가 능성의 검증을 통해 국내 제주도 토양 유래 호염성 세균 자원 확보의 의미와 함께 산업적 활용이 가능한 추가 연구 가 필요한 생물 소재로의 가치 판단을 위한 기초적인 연구 결과를 얻고자 하였다.
재료 및 방법
본 연구에 사용된 토양 시료는 제주도 남쪽에 위치한 대 포포구와 화순항 주변의 토양(5 cm × 5 cm 구역의 깊이 1 cm)을 시료로 확보하였으며 시료의 오염 방지 등을 위해 위생 장갑을 착용 후 멸균된 spatula를 이용하여 시료를 모 은 후 멸균된 50 mL conical tube에 담아 아이스박스에 보 관하여 이동하였으며 실험실에 도착한 후에는 실험전까지 4°C에서 보관하였다.
제주도 항구 인근 토양 시료로부터 호염성 미생물 분리 를 위해 각각의 샘플 1 g을 멸균된 0.85% 생리식염수에 첨가하여 교반기로 교반하여 현탁하였다. 현탁한 샘플 1 mL를 사용하여 10-1-10-4배로 단계희석 한 후, 일반 증식배 지로 해양미생물 전용배지인 marine agar (BD, USA) 배지 를 제작하여 희석액을 도말하고 37°C에서 호기적으로 호염 미생물을 배양하였다. 배양 후 선택적으로 배지상에 나타 나는 균의 크기, 모양, 색깔 등 형태학적 모습을 관찰한 후 동일한 고체배지를 사용하여 추가적으로 single colony isolation을 수행하였다. 순수분리된 균주의 혼합배지에서의 생육 가능성을 확인하기 위하여 n utr ient a gar (BD, USA), R2A agar (BD, USA), 및 t r yptic s oy a gar ( BD, USA)에 평판 도말법을 이용하여 37°C에서 7일간 정치 배양하였다. 또한 분리한 미생물들의 염 농도 변화와 pH 변화에 따른 생육 가능 여부를 확인하기 위해 marine agar (BD, USA) 배지를 바탕으로 고체배지를 제작하여 37°C에서 배양하며 생육을 확인하였으며 배양 온도에 따른 생육 가능 여부는 marine agar (BD, USA) 배지를 사용하여 30, 35, 40, 45, 50°C에서 배양하며 생육을 확인하였다.
제주도 항구 인근 토양 시료로부터 호기적 배양 조건에 서 분리된 균주들의 분자생물학적 동정을 위해 m ar ine agar (BD, USA) 배지에 각각 분리된 균주의 colony가 배 양된 상태의 고체 배지를 ㈜바이오팩트에 보내어 16S rRNA 염기서열의 분석을 의뢰하였으며 분석된 16S rRNA 염기서열로부터 가장 유사한 근연 균주의 확인을 위하여 ㈜천랩의 EzBioCloud (https://www.ezbiocolud.net/)를 사용 하였다. 계통학적 분석은 BioEdit 및 Mega-X 프로그램을 이용하였다.
분리된 호염성 미생물의 세포외 분해 효소 amylase, lipase, cellulase, protease 생산능 확인을 위하여 각각의 효 소와 특이적으로 반응할 기질 성분이 포함된 고체평판 선별 배지를 사용하였다. 먼저 amylase 생산능은 0.2% soluble starch (BD, USA)를, lipase 생산능은 1% Tween 80 (BD, USA)을, cellulase 생산능은 1% CMC (BD, USA)를, protease 생산능은 20% skim milk (BD, USA)를 기질로 선택하여 marine agar (BD, USA) 배지에 각각 첨가하여 제조하였으며 분리된 균주를 직접 접종하여 37°C에서 7일 배양한 후 저지원(Clear zone)의 직경으로 조사하였다. 분 리된 균주의 효소활성 분해능 평가는 배양 후 나타나는 접 종균 주위의 억제환의 크기(+++: >7 mm, ++: >4~7 mm, +: 1-4 mm)로 나타내었다.
분리된 균주의 auxin 생산능은 0.1% L-tryptophan이 첨 가된 marine broth (BD, USA) 배지에 순수분리된 colony 를 tooth-picking 한 후 37°C에서 5일 배양하여 Salkowski 시약(35% HClO4 50mL + 0.5M FeCl3 1 mL) 800 uL을 배 양 상등액 400 uL에 섞어준 후 어두운 곳에서 30min 반 응시켜 육안으로 확인하여 붉은 색깔 변화 정도에 따라 옥 신 생성능 정도를 표시하였다(짙은 붉은색: +++; 일반 붉 은색: ++; 옅은 붉은색: +; 주황색: w; 무색: -).
결과 및 고찰
제주도 남쪽에 위치한 대포포구와 화순항 주변의 토양 시료로부터 호기적으로 생육 가능한 호염성 세균의 분리 가능성을 검증하고자 marine agar 배지에 시료를 희석, 도 말하여 배양한 후, 배양된 colony의 모양, 색깔, 등 형태학 적 특징을 육안으로 구분이 가능한 균주들을 대상으로 동 일한 고체배지를 사용하여 2차로 단일 균주 분리를 수행하 였다. 그 결과 Table 1에서 나타낸 것처럼 대포포구 인근 토양 시료로부터 18균주와 화순항 인근 토양 시료로부터 28균주를 분리하여 호기성이며 호염성인 세균 총 46균주를 순수 분리하였다. 또한 주요 성분이 무기염으로 이루어진 marine agar 배지는 해양 미생물 배양에 유리한 배지이기 에 산업적 활용가능성을 확인하기 위하여 대량 배양 등에 많이 활용되는 혼합배지(nutrient agar, R2A agar, tryptic soy agar)에서의 분리 균주들의 생육 가능성을 확인한 결 과 46균주 중 3균주를 제외한 43균주(93.5%, weak growth 포함)가 최소 1종류 이상의 혼합 배지에서 생육이 가능한 것을 확인하였다. 이는 제주도 항구 인근 토양 시료로부터 호염성 세균 탐색에 있어서 분리 배지의 구성성분이 어느 정도 영향을 미치는 것으로 생각되며, 본 연구 결과를 바 탕으로 제주도 항구 인근 토양 시료로부터 호염성 세균 분 리를 위한 최적 배지는 marine agar 배지로 나타났다. 또 한 최적의 생육 pH 조건을 확인하기 위하여 pH를 5, 7, 9 로 각각 조절한 marine agar 배지에 분리 균주들의 생육을 확인해 본 결과 분리된 모든 균주가 pH 7과 pH 9에서 생 육이 가능(weak growth 포함)하였으며 이중 35균주는 pH 5에서도 생육이 가능(weak growth 포함)하였다(Table 1).
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제주도 항구 인근 토양 시료로부터 호기적으로 분리된 46균주의 1 6S r RNA 염기서열을 바탕으로 EzBioCloud를 사용하여 세균 동정을 실시한 결과 크게 3문 6목 8과 16 속 23종으로 나타났으며(Table 2), 분리 균주와 근연 균주 및 상동성을 Table 3에 나타내었다. Table 2에서 보는 바 와 같이 Firmicutes (Bacilli)가 50.0%로 우점도가 높았고, Proteobacteria (Gammaproteobacteria) 45.7%, Actinobacteria 4.3%로 나타났다. 가장 우점도가 높은 Firmicutes 문은 Bacillaceae 60.9%, Planococcaceae 21.7%, Exiguobacterium_f 가 17.4%로 구성되었으며, 총 3과 10속 15종이 분리되었다. 본 연구에서 가장 많이 분리된 Bacillaceae과는 Bacillus sp. 이 해양생물 중에서도 담수어에서 많이 분리되며 발효식품 중에서도 젓갈류에서 주로 분리된다는 것이 알려져 있기에 해양과 인접해 있는 제주도 항구 인근 토양 시료의 미생물 균총에서 가장 많이 분리된 것으로 예상되며(Lee, 1969;Hur, 1996;Yang et al., 2005;Nam et al., 2012), 특이하 게도 대포포구 인근 토양시료에서만 Bacillaceae과의 호염 성 미생물들이 분리되었으며 대포포구가 화순항 보단 상 대적으로 어업활동이 많이 이루어지고 있기에 나타나는 현상으로 추측되었다. Proteobacteria 문에서는 4과 5속 7 종이 분리되었으며 Halomonas 속이 7균주, Vibrio 속이 6 균주, Cobetia 속이 5균주, Oceanisphaera 속이 2균주, 그리 고 Marinobacter 속이 1균주 분리되었다. 본 연구에서 분리 된 Bacillus velezensis, Cobetia amphilecti, Marinobacter sediminum과 6균주가 분리된 Vibrio neocaledonicus 균주는 Han et al. (2019)의 연구결과에서 제주도 해양 및 토양시 료에서 분리된 균주들과 일치하는 균주로써 항구 주변의 해양시료나 토양시료에 분포하고 있는 균주로 예상되었다. 마지막으로 Actinobacteria 문에서 1속 1종이 분리되었다. 분리 균주 중 근연 균주와의 1 6S r DNA 염기서열 상동성 이 낮은 균주(96% 이하)는 확인 되지 않았다.
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수산물 유래 발효식품은 내장 등을 제거한 수산물 등에 염을 첨가함과 함께 다양한 미생물들이 생산하는 효소들에 의해 숙성 과정을 통해 만들어지는 전통 식품으로 알려져 있기에(Park et al., 2017) 분리된 호염성 균주들의 식품 산 업에 적용 가능한 가수분해 효소 탐색을 위한 추가 연구가 필요한 생물소재 자원으로써의 연구 가능성 및 화학비료 대체 개발 기술을 위한 미생물 균주로써의 사용 가능성을 확인하기 위해 세포외 가수분해 효소 생산 능력과 옥신 생 산 능력의 분석을 실시하였다. Fig. 1과 Table 3에 나타낸 것처럼 분리된 46균주 중 31균주(67.4%)에서 한 가지 이상 의 분해 효소 활성이 존재하는 것을 확인하였으며, amylase 활성을 보이는 25균주, lipase 활성을 보이는 1균주, protease 활성을 보이는 19균주를 확보하였고, 이 중 두 가지 이 상의 효소 활성을 가지는 14균주도 확인되었다. 또한, 본 연구에서 분리된 균주들의 옥신 생산능을 확인한 결과, 화순항 인근 토양에서 분리한 Halomonas hydrothermalis, Oceanisphaera psychrotolerans 6균주와 대포포구 인근 토 양에서 분리된 Priestia megaterium 균주 포함 총 7균주에 서 옥신 생산능이 확인되었다.
본 연구에서 수행한 결과들은 제주도 남쪽에 위치한 대 포포구와 화순항 주변의 토양 시료로부터 국내 세균 생물 자원의 다양성 확보 차원에서 큰 의미를 찾을 수 있을 것 이며 산업용 가수분해 효소 관련 생물공학 및 화학비료를 대체할 수 있는 친환경 미생물제제로의 사용을 위한 추가 적인 기초 연구가 필요한 생물소재로 활용이 가능할 것으 로 예상된다. 또한 본 연구를 통하여 분리한 모든 균주들 은 KRIBB 미생물가치제고사업단에 기탁하였다.
요 약
본 연구는 제주도 대포포구와 화순항 주변의 토양 시료 로부터 호기적으로 분리한 호염성 세균들의 다양성 및 특 성에 관하여 조사하였다. 46균주의 호염성 세균을 순수 분 리하였으며 16S r RNA 염기서열 분석 결과를 바탕으로 계 통학적 분석을 실시한 결과, 3문, 8과, 16속, 23종으로 구 성되어 있는 것을 확인하였다. 특히 Firmicutes 문 Bacilli 강은 50.0%의 분포를 나타내었으며 3과, 10속, 15종으로 Bacillus velezensis를 포함하는 Bacillaceae, Exiguobacterium_f와 Planococcacea로 분포하는 것을 확인하였다. Proteobacter 문 Gammaproteobacteria 강은 45.7%의 분포를 나타내었으 며 4과, 5속, 7종으로 Aeromonadaceae, Cobetia amphilecti 를 포함하는 Halomonadaceae, Marinobacter sediminum를 포함하는 Marinobacteraceae와 Vibrio neocaledonicus를 포 함하는 Vibrionaceae로 분포하는 것을 확인하였다. 그리고 분리한 균주들이 amylase, lipase, cellulase, protease 같은 산업적으로 유용한 효소를 생산하는지 확인하기 위하여 효 소 활성 평가를 실시하였으며, 31균주가 최소 한 종류 이 상의 효소 활성을 가지고 있는 것을 확인하였다. 또한 옥 신 생산능을 가지는 균주도 7균주가 확인되었으며 이는 본 연구를 통하여 분리한 균주들의 산업적 활용 가능성을 나 타내었다. 그러므로 이번 연구는 국내 유전자원 확보 및 시료의 호염성 세균의 다양성과 특성에 관한 과학적 지식 확장에 도움이 될 것으로 생각된다.
