발효 균주 탐색을 위한 목장 주변 토양에서 분리한 내염성 미생물의 다양성 및 효소 생산능 분석

국내의 제주 양떼 목장(제주시 애월읍 소재), 녹원 목장( 제주시 한림읍 소재), 아침미소 목장(제주시 월평동 소재) 의 토양으로부터 호염성 미생물 분리를 위해 각각의 샘플 을 멸균된 0.85% 생리식염수에 첨가하여 voltexing으로 현 탁하였다. 현탁한 샘플 1 mL을 사용하여 10⁻¹-10⁻⁴ 배로 단 계희석 한 후, 일반 증식배지로 해양미생물 전용배지인 marine agar (BD, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 배지에 3% NaCl을 첨가한 고체배지를 제작하여 희석액을 도말하여 37°C에서 호기적으로 호염미생물을 배양하였다. 배양 후 선택적으로 배지상에 나타나는 균의 크기, 모양, 색깔 등 형태학적 모습을 관찰한 후 동일한 고체배지를 사 용하여 추가적으로 single colony isolation을 수행하였다. 순수분리된 균주의 혼합배지에서의 생육 가능성을 확인하 기 위하여, nutrient agar (BD, Difco Laboratories), R2A agar (BD, Difco Laboratories), 및 tryptic soy agar (BD, Difco Laboratories)에 평판 도말법을 이용하여 37°C에서 7 일간 정치 배양을 하였다. 그리고 분리된 균주들이 호염성 균주로써 5%와 10% NaCl 농도에서도 생육이 가능한지를 확인하기 위하여 marine agar 배지에 5%와 10% NaCl을 첨가한 배지를 제작하여 분리 균주들의 생육을 확인하였으 며 최적의 생육 pH 조건을 확인하기 위하여 pH를 5, 7, 9 로 각각 조절한 marine agar 배지에 분리 균주들의 생육을 확인하였다.

국내외 다양한 염전으로부터 호기적 배양 조건에서 분리 된 균주들의 분자생물학적 동정을 위해 marine agar (BD, Difco Laboratories) 배지에 각각 분리된 균주의 colony가 배양된 상태의 고체 배지를 ㈜바이오팩트에 보내어 16S rDNA 염기서열의 분석을 의뢰하였으며 분석된 16S rDNA 염기서열로부터 가장 유사한 근연 균주의 확인을 위하여 ㈜천랩의 Ezbiocloud (https://www.ezbiocloud.net/)를 사용 하였다. 계통학적 분석은 Clustal W 및 MEGA X 프로그 램을 이용하여 확인하였다.

분리된 호염성 미생물의 세포외 분해 효소 amylase, lipase, protease 생산능 확인을 위하여 각각의 효소와 특이 적으로 반응할 기질 성분이 포함된 고체평판 선별배지를 사용하였다. 먼저 amylase 생산능은 0.2% soluble starch (BD, Difco Laboratories)를, lipase 생산능은 1% Tween 80 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을, protease 생산능은 2% skim milk (BD, Difco Laboratories)를 기질 로 선택하여 marine agar (BD, Difco Laboratories) 배지에 각각 첨가하여 제조하였으며 분리된 균주를 직접 접종하여 37°C에서 7일 배양한 후 투명환(Clear zone)의 직경으로 조사하였다. 분리된 균주의 효소활성 분해능 평가는 배양 후 나타나는 접종균 주위의 투명환의 크기(+++: > 7 mm, ++: 4-6 mm, + : 1-3 mm)로 나타내었다.

분리된 균주의 auxin 생산능은 0.1% L-tryptophan이 첨 가된 Marin broth (BD, USA) 배지에 순수분리된 colony를 tooth-picking 한 후 37°C에서 5일 배양하여 Salkowski 시 약(35% HClO₄ 50 mL + 0.5 M FeCl₃ 1 mL) 800 μL을 배 양 상등액 400 μL에 섞어준 후 어두운 곳에서 30 min 반 응시켜 육안으로 확인하여 붉은 색깔 변화 정도에 따라 옥 신 생성능 정도를 표시하였다(짙은 붉은색: +++, 일반 붉 은색: ++, 옅은 붉은색: +, 주황색: w, 무색: -).

국내의 제주 양떼 목장, 녹원 목장, 아침미소 목장의 토 양으로부터 식품 산업에의활용이 용이할 것으로 생각되는 호기적으로 생육 가능한 호염성 미생물을 분리하고자 marine agar 배지에 시료를 희석, 도말하여 배양한 후, 배 양된 colony의 모양, 색깔 등 형태학적 특징을 육안으로 구분이 가능한 균주들을 대상으로 동일한 고체배지를 사용 하여 2차로 단일 균주 분리를 수행하였다. 그 결과 Table 1에서 나타낸 것처럼 제주 양떼 목장 토양으로부터 38 균 주, 녹원 목장 토양에서 64 균주, 아침미소 목장의 토양으 로부터 14 균주가 각각 분리되었으며 본 실험을 통하여 호염성 미생물 총 116 균주를 순수 분리하였다. 또한 주 요성분이 무기염으로 이루어진 marine agar 배지는 해양 미생물 배양에 유리한 배지이기에 산업적 활용가능성을 확 인하기 위하여 대량 배양 등에 많이 활용되는 혼합 배지 (nutrient agar, R2A agar, tryptic soy agar)에서의 분리 균 주들의 생육 가능성을 확인한 결과 116균주 중 4균주(No. 58, 80, 107, 116)을 제외한 112균주(96.5%)가 최소 1 종 류 이상의 혼합 배지에서 생육이 가능(weak growth 포함) 한 것을 확인하였다. 그리고 분리 균주가 높은 염농에서도 생육이 가능한지를 확인하기 위하여 marine agar 배지에 5%와 10% NaCl을 각각 첨가한 배지를 제작하여 분리 균 주들의 생육을 확인한 결과, 5% NaCl 조건에서는 2균주를 제외한 모든 균주에서 생육이 가능(weak growth 포함)하였 으며 10% NaCl 조건에서는 78균주가 생육이 가능(weak growth 포함)한 것을 확인하였다. 또한 최적의 생육 pH 조 건을 확인하기 위하여 pH를 5, 7, 9로 각각 조절한 marine agar 배지에 분리 균주들의 생육을 확인해본 결과 분리된 균주 중 1균주(No. 95)를 제외한 모든 균주가 pH 7에서 생육이 가능하였으며 이중 25균주는 pH 5에서도 생육이 가능(weak growth 포함)하였으며, pH 9에서 생육 가능 (weak growth 포함)한 균주는 78균주였다(Table 1). 특히 제주 양떼 목장에서 분리한 균주들은 모두 pH 9에서 생육 이 가능한 것을 확인하였는데, 이는 섬이라는 지리적 위치 로 인하여 토양이 내륙에 위치하는 목장의 토양보다 알칼 리화되어 있는 것으로 추측된다.

국내의 제주 양떼 목장, 녹원 목장, 아침미소 목장의 토 양으로부터 호기적으로 분리된 116균주의 16S rDNA 염기 서열을 바탕으로 Ezbiocloud 분석서비스를 사용하여 미생물 동정을 실시한 결과 크게 4문 6강 14목 23과 30속 51종으 로 나타났으며(Table 2), 분리 균주와 근연 균주 및 상동성 을 Table 3에 나타내었다. 또한 분리 동정된 균주들 간의 유연관계를 확인하기 위하여 계통수를 작성하였다(Fig. 1). Table 2에서 보는 바와 같이 Firmicutes (Bacilli)가 41.4% 로 가장 우점도가 높았고, Actinobaceria (Actinobacteria_c) 가 32.8%, Proteobacteria (Gammaproteobacteria 11.2%, Alphaproteobacteria 6.9%, Betaproteobacteria 6.0%)가 24.1%, Bacteroidetes는 1.7%로 나타났다. 가장 우점도가 높은 Firmicutes 문은 Bacillaceae 77.1%, Staphylococcaceae 16.7%, Planococcaceae 6.2%로 구성되었으며, 총 3과로 5 속 16종이 분리되었다. 총 38균주가 분리된 Actinobacteria 문에서는 Microbacteriaceae 23.7%, Micrococcaceae 21.1%, Jonesiaceae 18.4%, Promicromonosporaceae와 Ruaniaceae 각 각각 7.9%, Corynebacteriaceae, Nocardiaceae, Nocardioidaceae가 각각 5.3%, Demequinaceae와 Streptomycetaceae 가 각각 2.6%로 구성되었으며, 총 10과로 15속 19종이 분 리되었다.

Fig. 1. Evolutionary relationships of taxa by using the 16S rDNA sequences of bacteria from the soil around the several ranches in Korea. The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method (Saitou and Nei, 1987). The optimal tree with the sum of branch length = 2.72807696 is shown. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) are shown next to the branches (Felsenstein, 1985). The evolutionary distances were computed using the Maximum Composite Likelihood method (Tamura et al., 2004) and are in the units of the number of base substitutions per site. This analysis involved 116 nucleotide sequences. Codon positions included were 1st+2nd+3rd+Noncoding. All ambiguous positions were removed for each sequence pair (pairwise deletion option). There were a total of 1599 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA X (Kumar et al., 2018).

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Table 2. Phylum analysis of halophilic microorganisms isolated from the soil around the several ranches in Korea

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총 28균주가 분리된 Proteobacteria 문에서는 Gammaproteobacteria 강에서 Halomonadaceae 17.9%, Lysobacteraceae 와 Pseudomonadaceae가 각각 10.7%, 그리고 Erwiniaceae 가 7.1%로 구성되었으며, Alphaproteobacteria 강에서는 Rhizobiaceae 17.9%, Sphingomonadaceae 7.1%, 그리고 Rhodobacteraceae가 3.6%로 구성되었으며, Betaproteobacteria 강에서는 Alcaligenaceae 17.9%와 Oxalobacteraceae가 7.1% 로 구성되어 있는 것을 확인하였으며 총 9과로 9속 15종 이 분리되었다. Bacteroidetes 문에서 Galbibacter 속 1종이 분리되었다. 또한 NWFY-22 (isolate name)로 나타낸 분리 균주는 근연 균주와의 16S rDNA 염기서열 상동성이 95.47%로 Galbibacter marinus로 동정되었으며 이는 신종 균주 가능성을 나타내는 것으로 녹원 목장 토양에서 분리 (과제기탁번호: NMC5-B356) 되었으며 이는 국내 생물 자 원의 다양성 확보 차원에서 의미가 있을 것으로 생각된다 (Table 3).

토양 미생물들은 토양으로 유입되는 낙엽, 볏짚 등 유기 물들을 세포외 분해효소를 분비하여 영양물질 등으로 분해 하기 때문에 호르몬(hormone), 비타민(vitamin), 식물생장 촉진물질 등을 생산하여 식물의 생장을 돕는다고 알려져 있기에 분리된 호염성 미생물 균주들의 식품 산업에 적용 가능한 신규 분해 효소 탐색 자원 및 미생물비료로써의 산 업적 응용가능성을 확인하기 위하여 세포외 분해 효소 생 산능 및 옥신 생산능 분석을 실시하였다.

Table 3에 나타낸 것처럼 분리된 116 균주에서 24 균주 를 제외한 모든 균주에서 한 가지 이상의 분해 효소 활성 이 존재하는 것을 확인하였으며, 두 가지 이상의 효소 활 성을 가지는 균주 중 특히 세 가지 효소에 대하여 활성을 모두 가지고 있는 4균주(과제기탁번호: NMC5-B326, NMC5-B328, NMC5-B372, NMC6-B428)도 확인되었다. 또한 옥신 생산능을 확인한 결과, 17균주에서 생산능이 확 인되었으며 제주 양떼 목장 토양시료에서 5균주, 녹원 목 장 토양시료에서 12균주가 분리되었으며 아침미소 목장 토 양시료에서는 옥신 생산능을 가진 균주는 분리되지 않았 다. 이는 국내 목장 주변의 토양이 식물생장을 촉진시킬 수 있는 미생물비료 연구에 활용할 수 있는 미생물 탐색 소재로써 중요한 원천소재로써의 활용가치가 높을 것으로 예상되었다. 본 연구에서 수행한 결과들은 국내 미생물 생 물 자원의 다양성 확보 차원에서 큰 의미를 찾을 수 있을 것이며 국내 목장 주변 토양시료에서 분해 효소 탐색을 위 한 새로운 균주 탐색 가능성과 식품 산업용 효소 및 미생 물비료 연구의 기본 생물소재로 활용이 가능할 것으로 예 상된다. 또한 본 연구를 통하여 분리한 모든 균주들은 한 국생명공학연구원 미생물가치제고사업단에 기탁하였다.