다양한 염전으로부터 호기적 조건에서 분리된 미생물의 다양성 및 효소 생산능 분석에 관한 연구

국내외 다양한 염전으로부터 호염성 미생물 분리를 위해 각각의 샘플을 멸균된 0.85% 생리식염수에 첨가하여 voltexing으로 현탁하였다. 현탁한 샘플 1 mL을 사용하여 10⁻¹-10⁻⁴배로 단계희석 한 후, 일반 증식배지로 해양미생물 전용배지인 marine agar (BD, NJ, USA) 배지를 제작하여 희석액을 도말하여 37°C에서 호기적으로 호염미생물을 배 양하였다. 배양 후 선택적으로 배지상에 나타나는 균의 크 기, 모양, 색깔 등 형태학적 모습을 관찰한 후 동일한 고 체배지를 사용하여 추가적으로 single colony isolation을 수행하였다. 순수분리된 균주의 혼합배지에서의 생육 가능 성을 확인하기 위하여, nutrient agar (BD, NJ, USA), R2A agar (BD, NJ, USA), 및 tryptic soy agar (BD, NJ, USA) 에 평판 도말법을 이용하여 37°C에서 7일간 정치 배양을 하였다.

국내외 다양한 염전으로부터 호기적 배양 조건에서 분리 된 균주들의 분자생물학적 동정을 위해 marine agar (BD, NJ, USA) 배지에 각각 분리된 균주의 colony가 배양된 상 태의 고체 배지를 ㈜바이오팩트에 보내어 16S rDNA 염기 서열의 분석을 의뢰하였다. 분석된 16S rDNA 염기서열로 부터 가장 유사한 근연 균주의 확인을 위하여 NCBI wensite의 BLAST search program (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)과 ㈜천랩의 Ezbiocloud (https://www. ezbiocloud.net/)를 사용하였다. 계통학적 분석은 Clustal W 및 Mega 6.0 프로그램을 이용하여 확인하였다.

분리된 호염성 미생물의 세포외 분해 효소 amylase, lipase, protease 생산능 확인을 위하여 각각의 효소와 특이 적으로 반응할 기질 성분이 포함된 고체평판 선별배지를 사용하였다. 먼저 amylase 생산능은 0.2% soluble starch (BD, NJ, USA)를, lipase 생산능은 1% Tween 80 (Sigma, MO, USA)을, protease 생산능은 2% skim milk (BD, NJ, USA)를 기질로 선택하여 marine agar (BD, NJ, USA) 배 지에 각각 첨가하여 제조하였으며 분리된 균주를 직접 접 종하여 37°C에서 7일 배양한 후 투명환(Clear zone)의 직 경으로 조사하였다. 분리된 균주의 효소활성 분해능 평가 는 배양 후 나타나는 접종균 주위의 투명환의 크기(+++ : > 7 mm, ++ : 4~6 mm, + : 1~3 mm)로 나타내었다.

분리된 균주의 auxin 생산능은 0.1% L-tryptophan이 첨가된 marin broth (BD, NJ, USA) 배지에 순수분리된 colony를 tooth-picking 한 후 37°C에서 5일 배양하여 Salkowski 시약(35 % HClO₄ 50 mL + 0.5 M FeCl₃ 1 mL) 800 uL을 배양 상등액 400 uL에 섞어준 후 어두운 곳에서 30 min 반응시켜 육안으로 확인하여 붉은 색깔 변화 정도 에 따라 옥신 생성능 정도를 표시하였다(짙은 붉은색: +++; 일반 붉은색: ++; 옅은 붉은색: +; 주황색: w; 무색: -).

국내외 염전에서 산업적 활용이 용이할 것으로 생각되는 호기적으로 생육 가능한 호염성 미생물을 분리하고자 marine agar 배지에 시료를 희석, 도말하여 배양한 후, 배 양된 colony의 모양, 색깔 등 형태학적 특징을 육안으로 구분이 가능한 균주들을 대상으로 동일한 고체배지를 사용 하여 2차로 단일 균주 분리를 수행하였다. 그 결과 Table 1에서 나타낸 것처럼 국내 신안 토판염과 장판염에서는 100균주와 26균주가 각각 분리되었으며 국내 곰소 타일염 에서는 36균주가 분리되었다. 그리고 국외 염전인 에티오 피아 rock salt와 lake salt에서는 각각 54균주와 14균주가 분리되었으며 본 실험을 통하여 호염성 미생물 총 230 균 주를 순수 분리하였다. 국내 염전에서 분리된 균주의 경우 상대적으로 토판염에서 많은 호염성 미생물이 분리되었는 데 이는 염전에 사용한 바닥소재에 따라 천일염은 토판염, 장판염, 타일염으로 구분되는데 장판염이나 타일염은 가소 성소재나 타일을 이용한 바닥에서 생산된 천일염이며 토판 염은 갯벌을 단단하게 다진 결정지 판 위에서 생산되는 천 일염이기에 갯벌에서 생육하는 다양한 호염성 미생물 균주 가 함께 분리된 것으로 예상된다(Park et al., 2000; Lee et al., 2007). 또한 주요성분이 무기염으로 이루어진 marine agar 배지는 해양미생물 배양에 유리한 배지이기에 산업적 활용가능성을 확인하기 위하여 대량 배양 등에 많이 활용 되는 혼합 배지(nutrient agar, R2A agar, tryptic soy agar) 에서의 분리 균주들의 생육 가능성을 확인한 결과 230균 주 중 62균주(26.9%)가 최소 1종류 이상의 혼합 배지에서 생육이 가능(weak growth 포함)한 것을 확인하였다. 이는 호염성 미생물세균의 탐색에 있어서 분리 배지의 구성성분 이 어느 정도 영향을 미치는 것으로 생각되며, 본 연구 결 과를 바탕으로 호염성 미생물 분리를 위한 최적 배지는 marine agar 배지로 나타났다. 또한 최적의 생육 pH 조건 을 확인하기 위하여 pH를 5, 7, 9로 각각 조절한 marine agar 배지에 분리 균주들의 생육을 확인해본 결과 분리된 모든 균주는 pH 7에서 생육이 가능하였으며 이중 19균주 는 pH 5에서도 생육이 가능(weak growth 포함)하였으며 pH 9에서 생육 가능(weak growth 포함)한 균주는 209균주 였다(Table 1).

국내외 다양한 염전으로부터 호기적으로 분리된 230균주 의 16S rDNA 염기서열을 바탕으로 NBLAST program과 Ezbiocloud를 사용하여 미생물 동정을 실시한 결과 크게 4 문 7목 12과 27속 64종으로 나타났으며(Table 2), 분리 균 주와 근연 균주 및 상동성을 Table 3에 나타내었다. 또한 분리 동정된 균주들 간의 유연관계를 확인하기 위하여 계 통수를 작성하였다(결과 미제시). Table 2에서 보는 바와 같이 Firmicutes (Bacilli)가 89.6%로 가장 우점도가 높았고, Proteobacteria (Gammaproteobacteria)가 9.6%, Actinobaceria 와 Bacteroidetes는 각각 0.4%로 나타났다. Firmicutes 문은 Bacillaceae 97.6%, Staphylococcaceae 1.9%, Carnobacteriaceae 0.5%로 구성되었으며, 총 3과로 17속 52종이 분리되었 다. 그리고 약 9.56%가 분리된 Proteobacteria (Gammaproteobacteria) 문에서는 Kangiellaceae 45.5%, Halomonadaceae 18.2%, Marinobacter_f 13.6%, Moraxellaceae 9.1%, 그리고 Alteromonadaceae, Oceanospirillaceae와 Pseudomonadaceae 가 각각 4.5%로 구성되었으며, 총 7과로 8속 10종이 분리 되었다. Actinobateria 문과 Firmicutes 문에서 Micrococcus 속과 Gramella 속 1종씩이 분리되었다. 본 연구에서 가장 많이 분리된 Bacillaceae 과는 Halobacillus sp.이 염전에서 많이 분리된다는 것이 알려져 있기에 본 연구에서도 국내 외 다양한 염전 시료에서 43.9%로 가장 많이 분리된 것으 로 예상되었으며(Na et al., 2011) Photobacterium 속, Vibrio 속과 같은 어류병원체 관련 균주는 분리되지 않았 다. 그리고 국외 염전 시료에서만 Oceanobacillus sp. 25 균주가 분리되었는데 이는 분리원이 위치한 지역이 지구상 에서 가장 평균기온이 높은 곳이며 우수한 내염성을 가진 균주로 알려져 있기에 고온균이며 내염성이 우수한 균주의 분리가능성을 나타냈다(Morell, 2005; Lu et al., 2001). 또 한 분리 균주 중 근연 균주와의 16S rDNA 염기서열 상동 성이 낮은 10균주(96% 이하)는 신종 균주 가능성을 나타 내는 것으로 국외 염전 시료에서 6균주와 국내 염전 시료 에서 4균주(과제기탁번호: NMC5-B330, NMC6-B431, NMC6-B408, NMC4-B516)가 분리되었으며 국내에서 분리 된 균주들은 모두 국내 생물 자원의 다양성 확보 차원에서 큰 의미가 있을 것으로 생각된다.

Table 2. Phylum analysis of aerobically cultured halophilic microorganisms isolated from the commercial salts

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