서 론
현재 영양가가 높고 지방이 적으며, 질병으로부터의 위 험에 대해 부정적 관계가 있다고 과학적으로 인정된 생체 활성 화합물들이 많이 존재하는데, 이러한 물질들이 풍부 한 음식들에 대한 소비자의 관심이 증가하고 있다 (Roberfroid, 2007; Ruggeri et al., 2008). 그중에서도 특히 식물성 천연 물질에 대한 관심이 증가하면서 천연 물질의 기능성 물질 연구가 활발하게 이루어지고 있고, 수목의 잎 이나 목재 등의 추출성분 중 생리기능이 뛰어난 물질들의 활용방안 연구도 신속히 진행되고 있다. 하지만 이러한 연 구는 대부분(Lee & Park, 2011; Sung et al., 2014)과 같이 활엽수가 주로 이용되어 왔으며 침엽수 활용에 대한 연구 는 매우 제한적이다(Jang et al., 2008).
대표적인 침엽수의 하나인 소나무(Pinus densiflora Sieb. et Zucc.)는 한국, 중국, 일본 등에 주로 자생하며 사철 푸 른나무로 잎에는 클로로필과 비타민이 풍부하며, 플라보노 이드, 안토시안, 카로틴, 수지 등이 함유되어 있어서 예로 부터 건강식품으로 많이 이용되어왔다(Lim et al., 2001b; Ryu et al., 2017). 특히 한국에서의 적송은 오래 전부터 전통 의약품 영양제로 사용되어 왔다. 또한 소나무에 존재 하는 항산화물질이 노화 방지 및 심혈관질환, 암, 고혈압 그리고 당뇨병과 같은 만성 질환을 예방해준다고 한다 (Supeno et al., 2017).
그중 소나무 껍질엔 polymer 형태의 polyphenol 성분이 50년 이상 축척된 물질로서 주로 함유되어 있고 강력한 항 균활성(Lim et al., 2001a; Lim et al., 2001b; Torras et al., 2005), 항산화활성(Shin, 2005), 관능 및 저장성 증진(Hong et al., 2008; Park, 2009), 면역력 증진 등 항염증 활성을 포함한 다양한 인체생리활성 효능을 지닌 것으로 보고되었 다(Park, 2009).
또한 프랑스 해상 소나무 껍질에서 추출한 분말형태의 추출물인 pycnogenol은 천연의 polyphenol계 항산화물질 bioflavonoids가 들어있는 물질로 세계에서 가장 많이 사용 되는 허브 성분 식품 보충제 중 하나다(Rohdewald, 2005). 해외에서는 pycnogenol을 이용한 다양한 실험과 요구르트, 과일 주스 등의 제품 연구(Ruggeri et al., 2008;Frontela et al., 2010)가 활발히 이루어지고 있다. 한국에서는 국내 적송 솔잎을 이용한 쿠키, 빵 등의 다양한 연구(Jin et al., 2006; Choi et al., 2007)가 이루어지고 있지만 소나무껍질 추출물을 이용한 제품 연구는 막걸리, 유기축산 사료첨가 제(Kim et al., 2009; Supeno et al., 2017) 외에는 부족한 실정이다(Ryu et al., 2017). 그러나 pycnogenol의 연구 사 례처럼 국내 적송에서 추출한 소나무껍질추출물인 pineXol 또한 다양한 제품으로 개발될 수 있을 것으로 기대된다 (Park, 2009).
맥주는 보리를 발아시켜 맥아를 만들 때 생기는 α- amylase, β-amylase 효소들이 전분을 분해하여 당분을 만 들고 생성된 당을 효모가 이용해 발효시켜 만든 단행복 발효형 발효주이다(Jung & Chung, 2017;Sung & Lee, 2017). 현재 맥주 생산 기술은 대체 식물성 원료를 첨가 하여 새로운 품종을 개발하는 것을 목적으로 하고 있으며, 이것은 음료에 특정한 맛을 부여하고 농산물에 대한 수요 를 증가시킨다(Penkina et al., 2017a). 또한 식물성 원료 를 첨가함으로써 맥주에 산화방지제로서의 역할을 하며 인체에 미치는 알코올의 산화 및 독성 영향을 줄일 수 있 고, 기능적인 효과, 관능적 향상 그리고 더 긴 유통기한을 가질 수 있는 이점이 있다(Penkina et al., 2015; Penkina et al., 2017b).
따라서 본 실험에서는 천연 식물성 기능성 물질 중 하나 인 pineXol을 맥주 발효 과정 중에 다양한 비율로 첨가하 여 항산화기능과 관능적 특성이 향상된 기능성 맥주를 개 발하고자 한다.
재료 및 방법
본 연구에 사용된 소나무껍질추출물(PineXol)은 뉴트라 팜에서 강원도 적송을 원료로 만든 것으로 2018년 10월 16일에 제조한 제품이다. 맥주 제조 시 필요한 재료 Pilsen malt (Briess, Chilton, MA, USA), Cascade 4.5-7% pellets (Yakima Chief, Yakima, WA, USA) 그리고 Safale US-05 yeast (Saccharomyces cerevisiae, Belgium)는 서울 홈브루(Seoul Homebrew, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 맥아는 분쇄 후 표준체(12 mesh)를 사용하여 체에 통과시 킨 후 사용하였다. 맥주의 발효에 필요한 균주는 맥아 23.5 g과 증류수 100 mL를 당화과정과 멸균과정을 거친 맥 즙에 효모를 1 g을 넣고 25°C에 48시간 2회 계대배양 시 켜 준비했다.
소나무껍질추출물 맥주는 Yang et al. (2017)의 방법을 참고하여 Table 1의 배합비에 따라 배합하고 Fig. 1의 방 법으로 맥주를 제조하였다. 분쇄 과정을 거친 맥아를 항온 수조에서 67°C로 60분간 10분마다 30초씩 100 rpm으로 흔 들어 당화액을 제조하였다. 이후 맥아는 걸러내고 홉을 첨 가한 뒤 60분간 가열하고 30°C까지 chilling 과정을 거쳤다. Ale 맥주 발효에 첨가한 효모액은 맥아즙 총량의 0.5%(v/ v)로 생존 균수가 5 log CFU/mL 수준이 되도록 계산하여 wort에 첨가하였고 이 과정에서 소나무껍질추출물을 각 시 료별로 일정 비율 첨가하였다.
소나무껍질추출물맥주의 비중은 100 mL 메스실린더에 시료 100 mL를 넣고 비중계(200-DK-6, Deakwang, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였고, pH는 pH meter (PHM 210, Radiometer, Lyon, France)를 이용하여 측정하였다.
멸균 식염수 9 mL에 시료 1 mL를 혼합하여 10배 단계희 석법으로 희석한 후, 각각의 희석액 1 mL를 취하고 배지를 분주하였다. 균수 측정배지는 PDA 배지(Potato Dextrose Agar; Difco, NJ, USA)를 사용하였고, 25°C 항온기에서 72시간 배양한 후 생성된 집락수를 계수하였다.
원심분리를 과정을 거친 시료의 상등액 10 mL를 투명한 페트리접시(50×12 mm)에 담아 색차계(Color Reader, CR- 20, Konica Minolta, Inc., Tokyo, Japan)를 사용하여 Hunter L (lightness), a (redness), b (yellowness)를 측정하였다. 이 때 표준 백색판의 L, a, b 값은 각각 95.1, -0.1, 3.9이었다.
환원당 측정은 DNS법으로 측정하였다. 시험관에 DNS 용액 2 mL, 증류수 7 mL 그리고 시료 1 mL를 혼합하여 중탕으로 105°C에서 5분간 가열하였다. 가열된 시료의 온 도를 상온까지 낮추어 UV spectrophotometer (Genesys10 UV, Thermo spectronic Co., US)로 540 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 표준곡선은 glucose (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 단계별 희석하여 작성하였다.
가용성 고형분은 당도계(N-2E, Atago, Tokyo, Japan)로 측정하여 Brix°로 나타내었다. 맥주의 알코올 함량은 증류 법으로 분석하였으며, 증류 후 알코올-온도 보정표에서 15°C로 보정한 알코올 함량을 표준 보정곡선에 대입하여 알코올 함량(%, v/v)을 계산하였다.
총 플라보노이드 함량은 Zhishen et al. (1999)의 방법 을 참고하여 표준물질로 catechin을 사용하여 aluminium trichloride 방법에 따라 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 Taga et al. (1984)의 방법을 약간 변형시켜 Folin-Ciocalteau 법에 따라 측정하였고, 표준물질로는 gallic acid를 사용하 였다.
DPPH 자유라디칼에 대한 환원력 측정은 Blois의 방법에 따라 Cho et al. (2009)의 방법을 응용하여 측정하였다. Methanol에 맥주 시료를 10배 희석한 다음 20분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 분석시료용액으로 사용하였다. 분 석시료용액과 0.2 mM DPPH 용액을 1:4 비율로 혼합한 것을 96 well plate에 triple로 분주하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후 methanol을 대조군으로 하여 ELISA reader (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)로 520 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 다음과 같은 식 으로 구하였다.
결과 및 고찰
발효와 저장 기간 동안 소나무껍질추출물 맥주의 가용성 고형분, 환원당 그리고 비중은 Table 2에 제시한 바와 같다.
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모든 시료에서 발효 0일차에 가용성 고형분은 12.5 Brix° 수준으로 유사했으며, 발효 기간에 많은 감소를 보였 고 저장 기간에는 5.5-5.6 Brix°로 평이한 수준을 보였다.
환원당도 가용성 고형분과 유사하게 모든 시료에서 맥주 제조 후에 11 g/100 mL의 값을 보였고, 발효 기간에 많은 감소를 보였으며 저장 기간에는 1.4-1.5 g/100 mL의 값을 나타냈다.
마찬가지로 비중도 발효 0일차에 모든 맥주 시료에서 1.054-1.055 g/cm3의 값을 나타냈고, 발효 기간에 값이 매우 감소하여 저장 기간에는 1.008-1.010 g/cm3의 값을 보였다.
맥주의 발효와 저장 기간 동안의 pH 값은 Table 2에 나 타난 것과 같다. 제조 직후 pH는 소나무껍질추출물의 함량 이 높을수록 더 낮은 pH를 보였다. 그리고 모든 맥주 시 료에서 발효가 끝난 후 pH는 매우 감소하였고, 그 후 유 의적으로 상승하였다(p<0.05). 저장이 끝난 맥주 중 대조군 을 제외하고는 추출물의 함량이 높을수록 pH가 더 낮은 수치를 나타내었고 Lee et al. (2017)의 결과와 비슷한 수 치를 보였다.
맥주의 발효와 저장 기간 중의 색도는 Table 3에 나타난 바와 같다.
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L값은 발효와 저장 기간 전반에 걸쳐 소나무껍질추출물 의 함량이 높을수록 유의적으로 더 낮은 값을 보였고, 전 시료에서 발효기간이 끝났을 때 L값이 높아졌다(p<0.05). Yom (2008)의 연구에서 맥주의 polyphenol에 속하는 tannoid 는 맥주가 lagering하는 동안 tannin으로 변하여 단백질과 결합함으로서 haze particle이 된다고 한다. 또한 Siebert (2006)의 연구에서는 음료 혼탁의 큰 원인을 단백질과 폴 리페놀 사이의 상호작용이라고 하였다 따라서 껍질추출물 의 함량이 더 높은 맥주의 L값이 더 낮은 것으로 보인다.
반대로 a값은 발효와 저장 기간 전반에 걸쳐 소나무껍질 추출물의 함량이 높을수록 유의적으로 더 높은 값을 보였 고 이는 Lim et al. (2001a)의 실험에서 김치에 추출물을 넣었을 때 발효 기간 전반에 거쳐 L값이 control이 제일 높았고, a값이 control이 낮은 것과 유사하였다(p<0.05). b 값 또한 소나무껍질추출물의 함량이 높을수록 유의적으로 더 높은 값을 보였으며, 발효와 저장 기간이 진행되면서 b 값은 전반적으로 낮아졌다.
소나무껍질추출물 맥주를 25°C에서 5일간 발효시키면서 1일 마다, 2°C에서 15일간 저장하면서 5일마다 효모 수와 알코올함량의 변화를 측정하여 각각 Fig. 2, 3에 나타내었 다. 초기 효모 수는 5.20 log CFU/mL 수준으로 조절하였 다. 발효 2일차에 소나무껍질추출물의 첨가량이 높을수록 효모 수가 더 많았으며 p0.125가 7.85 log CFU/mL로 가장 높은 값을 보였다. 따라서 첨가구의 효모가 대조군의 효모 보다 더 높은 발효력을 가진 것으로 판단하였고, 이에 대 해서는 후에 추가 실험이 필요할 것으로 사료된다. 이후 발효 5일차까지는 모든 시료에서 유의적 차이를 보이지 않 았으며 저장 기간에는 추출물의 함량이 높을수록 효모 수 의 감소가 적었다(p<0.05). 저장 15일차에 모든 시료의 효 모 수가 Jung & Chung (2017)과 같이 6.00 log CFU/mL 수준으로 감소하였고 대조군이 첨가구에 비해 6.25 log CFU/mL로 가장 낮은 값을 보였다. 이는 소나무껍질추출물 의 항산화능이 활성산소로 인한 yeast stress를 효율적으로 감소시켜 효모의 생존력을 향상시킨 것으로 추측된다 (Jamieson, 1998; Yom, 2008).
맥주의 알코올 함량은 모든 시료에서 발효 3일차까지 크 게 증가하다가 그 후로는 완만한 증가를 보였다(p<0.05). Kim et al. (2014)의 연구에 따르면 알코올의 변화는 환원 당이 매우 낮은 값을 유지하는 것과 밀접한 관련이 있다고 한다. 그리고 발효 2일차에서 소나무껍질추출물의 함량이 높을수록 더 높은 알코올 함량을 보였는데 Lee et al. (2013)의 연구에 따르면 효모의 발효력이 추출물의 함량이 더 많을수록 강해져서 시료별로 차이가 있었던 것으로 보 인다(p<0.05). 저장 이후 맥주 시료에서의 알코올 생성은 6 도 정도로 비슷한 수치를 보였다.
발효와 저장 중의 항산화실험에 대한 결과는 Table 4와 같다. 발효와 저장 과정을 거치면서 폴리페놀의 함량은 유 의적으로 줄어들었다. 전반적으로 소나무껍질추출물의 함 량이 높은 맥주일수록 폴리페놀의 함량이 높았지만 p0.1과 p0.125의 저장 15일차 폴리페놀 함량은 373 μg/mg 정도로 유사했다. 따라서 맥주에 소나무껍질추출물을 0.1% 이상 첨가하는 것은 바람직하지 않다고 판단되었다.
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플라보노이드의 함량 또한 추출물의 함량이 높은 맥주가 더 많은 폴리페놀 함량은 보였다. 하지만 발효와 저장기간 을 거치면서 추출물의 함량이 더 높은 맥주가 폴리페놀 함 량의 감소 폭이 크게 보였다.
DPPH 라디칼 소거능도 마찬가지로 소나무껍질추출물의 함량이 더 많을수록 더 강한 항산화력을 보였다.
소나무껍질추출물 맥주의 색, 단맛, 신맛, 쓴맛, 입안에서 의 느낌, 향기, 전반적인 기호도를 평가한 결과를 Table 5 에 나타내었다. 신맛, 쓴맛, 입안에서의 느낌, 전반적인 기 호도의 평가 점수는 추출물의 첨가량에 상관없이 모두 유의 적인 차이를 보이지 않았다(p<0.05). 한편 색은 대조군보다 첨가구의 기호도가 더 높았으며, 단맛과 향기의 기호도는 p0.05가 제일 높았다. 따라서 소나무껍질추출물을 0.05% 첨 가한 맥주가 관능적으로 가장 우수하다고 판단되었다.
요 약
본 연구에서는 맥주에 소나무껍질추출물을 0-0.125%를 첨가한 6개의 필스너 맥주를 제조하였다. 발효와 저장기간 동안 실험군의 pH, 환원당, 가용성 고형분, 비중, 알코올의 수치는 대조군과 유사한 변화를 보였고 저장 후의 값은 모 든 시료에서 유사하게 나타났다. 폴리페놀, 플라보노이드, DPPH와 같은 항산화 수치는 pineXol의 첨가량이 높을수 록 더 높은 항산화력을 보였다. 하지만 저장 후의 p0.1과 p0.125의 폴리페놀 수치는 373 μg/mg 정도로 유사하게 나 타났다. 또한 효모 수는 p0.125가 발효 2일차에 7.85 log CFU/mL로 최대 효모 수를 나타내었고 저장 후에도 p0.125의 효모 수가 가장 높은 수치를 보였다. 발효와 저 장 중의 L value는 소나무껍질추출물의 함량이 높을수록 더 낮은 수치를 보였고, a value와 b value는 추출물의 함 량이 높을수록 더 높은 수치를 보였다. 관능검사에서 단맛 과 향기의 기호도가 p0.05가 제일 높았고 색을 제외한 다 른 요소는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 따라서 소나 무껍질추출물을 0.05% 첨가한 맥주를 제조하였을 때 효모 의 발효력, 항산화 및 관능적 요소가 우수할 것으로 판단 되었으며, 다양한 천연 기능성 물질을 이용한 맥주 개발이 가능할 것으로 사료되었다.
