서 론
뽕잎은 1998년 식품공전에 등재된 후 각종 가공식품 및 건강식품의 원료로 꾸준히 이용되고 있다. 뽕잎의 유용성 분으로 알려진 플라보노이드계의 루틴은 모세혈관 강화작 용과 수축작용을 나타내며, 혈압강하물질로 알려져 있는 GABA (γ-aminobutyric acid) 성분은 녹차 잎에 비해 약 10배 이상 많이 함유 되어있는 것으로 밝혀졌다(Chae et al., 2003). 또한 뽕잎에는 β-sitosterol, campesterol 등 식물 성 스테롤이 다량으로 존재하여 혈중 콜레스테롤과 중성지 질의 저하작용, HDL-cholesterol의 증가 및 항산화작용 등 의 기능을 나타내는 것으로 알려지고 있다(Shin, 1998). 당 뇨에 대한 뽕잎이나 상백피의 효용성에 관해서는 이미 오 래 전부터 잘 알려져 왔으나 근래 뽕잎에 α-glucosidase에 대한 저해활성을 갖는 1-deoxynojirimycin (DNJ) 및 그 밖 에 여러 종류의 알칼로이드가 함유되어 있어 이들 성분에 의해 혈당강하 효과가 나타나는 것으로 밝혀졌다(Asano et al., 1994). 이에 따라 뽕잎과 뽕으로 사육한 DNJ 함유 누 에가루의 혼합물을 당뇨쥐에게 처리하여 혈당강하의 유의 적인 증가를 보고한 사례가 있으며(Jang & Rhee, 2004), 또한 오디, 뽕잎 및 누에가루의 혼합물을 급여한 당뇨쥐에 서 항산화작용을 비롯한 당뇨합병증의 뚜렷한 개선 효과가 인정된 바 있다(Kwon et al., 2006).
뽕잎에 존재하는 DNJ는 포유동물의 소장에 존재하는 α- glucosidase의 활성을 저해함으로써 소장에서 혈액으로의 포도당 유입을 억제하는 작용이 있으며, 이 점을 이용하여 식후 고혈당증을 유발하는 insulin 비의존형 당뇨병 환자들 의 혈당강하제로 이용되고 있다(Yagi et al., 1976). 이러한 뽕잎을 이용하여 이미 우리나라에서도 뽕잎을 이용한 식품 으로 국수, 차, 음료, 과자, 아이스크림, 빵, 떡, 우유두부, 계육 소세지 등과 뽕나무의 부산물인 오디를 이용한 술과 쨈 등의 식품이 개발되어 일부 시판하고 있으나 시장성이 매우 취약한 상황이다. 이러한 이유는 뽕잎을 이용한 식품 이 각종 성인병의 예방 및 치료에 효과를 지닌 기능성 성 분을 함유하고 있어 기능성 소재로는 우수하나 맛이 매력 적이지 못하고 특유의 향으로 대중적이지 못하다는 것이다 (Ye, 2009). 예를 들면 뽕잎차와 녹차의 맛을 비교할 때 뽕 잎차가 녹차의 맛과 향에 뒤떨어져 상품의 가치가 낮다는 것인데, 이러한 점을 보완하여 제품을 개발한다면 뽕잎을 첨가한 유가공품(우유, 요쿠르트치즈, 버터 등), 유가공품 및 냉동식품, 제과 제빵, 김치류, 장류, 소스류, 과류, 음료 등 상품의 시장성이 클 것으로 사료된다(Kim & Yuh, 2004).
최근 프로바이오틱스로 주목받고 있는 유산균들은 내산 성, 내담즙성, 내염성이 우수하여 위산 통과율이 좋고, 장 에 도착해 장내 유익균을 늘리고 장의 균형을 유지시키는 데 뛰어난 것으로 알려져 있다(Moon, 2019). 그동안 식물 성 재료를 이용하여 발효음료를 제조하기 위한 연구는 당 근에 bifidobacteria를 배양하여 발효음료를 제조하는 방법 (Park et al., 1997), 과채류를 일정 비율로 섞어 배양하여 제조하는 방법(Kim et al., 1989) 등에서 시도되었으며 뽕 잎에 유산발효를 하면 풍미가 개선되고 관능적 특성을 향 상시킬 수 있을 것으로 예상된다. 이에 본 연구는 식용식 물로서 만이 아니라 약용으로도 가치가 인정되는 뽕잎을 유산균으로 발효하여 제조한 발효 뽕잎추출물의 맛과 기능 성 등의 품질특성을 조사하여 식품소재로서 이용 가능성을 검토하고자 하였다.
재료 및 방법
본 연구에서 사용한 뽕잎은 남양주시 조안군 조안면에서 직접 채취한 국내산 뽕잎을 수세한 후 사용하였다. MRS broth는 Becton Dickinson (Becton Dickinson Inc., Sparks, MD, USA), MRS Agar는 Yakuri (Yakuri Pure Chemicals Inc., Kyoto, Japan), HPLC 분석용 용매는 J.T Baker (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA), 탄닌산은 Samchun (Samchun Pure Chemical, Pyeongtaek, Korea), 여과지(Whatman No. 2)는 Whatman (Whatman Inc., Springfield Mill, UK), 2,2- Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)는 Sigma (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 발 효 뽕잎을 제조하기 위해 사용한 균주는 Leuconostoc mesenteroides (KCCM 40709) 및 Lactobacillus plantarum (KCCM 12116)과 Lactobacillus sakei (KCCM 40264)를 MRS배지에 접종하여 각각 26°C, 37°C 및 30°C에서 배양 하며 생장곡선을 확인 후 사용하였다.
건뽕잎(dried mulberry leaves, DM) 및 발효뽕잎(fermented mulberry leaves)의 제조는 Fig. 1과 같이 행하였다. 먼저 뽕잎 및 말토덱스트린, 그리고 효모추출물을 배합하여 배 지를 조제하고 121°C에서 15분간 가압 멸균을 한 후 무균 상태에서 냉각하였다. 각각의 유산균 생장곡선 결과에 따 라서 초기 균수로 2×107 cfu/mL을 넣기 위해 전체 배지에 대하여 각각 Leu. mesenteroides는 0.43%, L. plantarum은 0.90%, L. sakei는 0.50% 접종을 하였다. 배양기에서 Leu. mesenteroides 이 접종된 뽕잎배지를 생육 적온인 26°C에 서 발효하여 MLm을 얻었으며, L. plantarum로 30°C에서 발효한 MLp 및 L. sakei로 37°C에서 발효한 MLs를 얻은 후 -80°C에서 24시간 동결시킨 뒤 동결건조기를 사용하여 건조 및 분쇄 후 실험에 사용하였다. DM은 수세가 끝난 뽕잎을 동결시키고 동결 건조기에서 건조한 후 분쇄하여 제조하였다. 이 후 건조중량의 10배수에 해당하는 80% 에 탄올로 2시간 환류 추출 후 여과, 감압농축 및 동결건조하 여 발효뽕잎 추출건조물을 제조하였다.
관능 평가용 요쿠르트의 제조는 Fig. 2와 같이 행하였다. 12% 탈지분유를 90°C에서 30분간 살균하고 무균상에서 냉 각한 후 플레인 모닝 프로바이오틱스(Duolac, Cell Biotech, Gimpo, Korea)를 별도의 배양 없이 직접 스타터로 접종하 여 37°C에서 24시간 발효시켰다. 발효가 끝난 요쿠르트는 각각의 처리구에 DM, control(유산균을 접종하지 않은 뽕 잎배지), MLm, MLp, MLs를 각각 0.5%(w/w) 첨가하고 균질화 시킨 후 4°C 냉장고에서 보관하며 관능 평가에 사 용하였다. 관능평가는 식품생물공학 전공 실험생 30명을 검사원으로 하여 색(color), 신맛(sourness), 감칠맛(umami), 쓴맛(bitterness) 및 전체적인 기호도(overall acceptability)에 대하여 9점 척도법으로 평가하였다.
뽕잎의 성분 중 DNJ의 함량을 분석하기 위한 HPLC의 조건은 Hwang (2002)의 방법을 응용하였으며 Table 1과 같았다. 발효 뽕잎의 DNJ 함량 측정은 뽕잎 1,000 mg을 HPLC용 80% 에탄올 100 mL에 넣어 2회 환류 냉각 추출 및 농축 후에 동결건조하여 얻은 건조물 10 mg을 증류수 1.0 mL로 녹여 사용하였다. 이 후 증류수에 용해시킨 추출 물 용액(10 mg/mL) 0.2 mL에 200 mM 탄산수소나트륨 용 액 0.2 mL을 첨가하고 아세톤에 용해시킨 5mM 9- fluorenylmethyl chloroformate 0.4mL을 첨가한 후, 30°C에서 30분간 반응시켰다. 그 후 혼합용액을 아세트산에틸:헥산 (20:80, v/v)으로 추출하여, 상등액은 제거하고 잔류액을 0.45 μm 여과지로 여과하여 시료로 사용하였다. 시료는 10 μL씩 취해 HPLC에 주입하여 분석하였다.
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총 폴리페놀 화합물의 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdate와 반응하여 청색을 나타내는 현상을 이용한 Folin-Denis법을 일부 변형시켜 측정하였다(Swain et al., 1959). 즉, Control, MLm, MLp, MLs 각각의 80% 에탄올 추출물을 1mg/mL의 농도로 용해 후 0.2mL을 시험관에 취 하고 증류수를 가하여 2 mL로 만든 후에 Folin-Ciocalteau phenol reagent를 0.2 mL 첨가하여 잘 혼합하고 3분간 실 온에서 방치하였다. 이어서 탄산나트륨 포화용액 0.4 mL를 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 mL로 만든 후, 실온 에서 1시간 방치하여 얻은 상층액의 흡광도를 725 nm에서 측정하였다. 이 때 총 폴리페놀 화합물의 표준정량곡선은 탄닌산 1 g을 50% 에탄올 1 mL에 녹이고 최종농도가 0, 31.125, 62.25, 125, 250 및 500 μg/mL 용액이 되도록 취 하여 위와 같은 방법으로 725 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.
각 시료 추출물의 플라보노이드 함량은 diethylene glycol 비색 방법을 응용하여 측정하였다(Nfri, 1990). 1 mg/mL 농 도로 methanol에 용해시킨 각 추출시료 100 μL를 diethylene glycol 1 mL과 혼합하여 5분간 반응시키고 다시 1 N NaOH 100 μL와 섞어 37°C에서 30분간 반응 후 420 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 이때 플라보노이드 함량은 퀘르 세틴을 이용하여 검량선을 작성하여 추출시료의 플라보노 이드 함량을 시료 1 g 중의 mg 퀘르세틴으로 계산하였다. 퀘르세틴을 이용한 검량선은 최종농도가 0, 31.125, 62.25, 125, 250 및 500 μg/mL 용액이 되도록 취하여 위와 같은 방법으로 420 nm에서 흡광도를 평가하여 작성하였다.
각 시료의 전자공여능(Electron Donating Ability, EDA) 은 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능을 Choi et al. (2003)의 방법을 응용하여 측정하였다. 여러 발 효뽕잎 추출물 시료를 80% 에탄올로 용해하여, 1.8 mL의 DPPH용액(100 μM)과 각 시료 0.2 mL을 혼합하고 암소에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Korea)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하 였다. 대조군으로는 아스코르브산(Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. 전자공여능은 각 실험을 3회 반복하여 평균을 낸 다음 대조구에 대한 흡광도의 감 소 정도를 다음 식에 의하여 계산하였다.
각 시료 추출물의 α-glucosidase 저해효과는 Sa et al. (2010)의 방법을 응용하여 측정하였다. 각 추출시료 2 mL를 α-glucosidase 효소액(0.05 U/mL) 50 μL, 200 mM 인산칼륨 완충액(pH 6.8) 750 μL와 혼합하여 37°C에서 15분간 반응시 킨 후 2mM pNPG(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside) 100 μL 를 가하여 37°C에서 10분간 반응시켰다. 이후 0.1M 탄산나 트륨 750 μL로 반응을 정지시키고 405 nm에서 측정한 흡광 도에 따라 아래와 같이 α-glucosidase 저해활성을 계산하였다.
결과 및 고찰
식품소재로서 발효뽕잎의 관능적 특성을 조사하기 위하 여 플레인 요쿠르트에 건뽕잎과 발효뽕잎을 각각 0.5% (w/ w)씩 첨가하여 색(color), 신맛(sourness), 감칠맛(umami), 쓴 맛(bitterness) 및 전체적인 기호도(overall acceptability)등을 9점 척도법으로 비교 한 결과는 Table 2와 같았다. 건뽕잎 을 첨가한 요쿠르트는 전체적인 기호도에서 4점대의 점수 를 받았는데 이는 건뽕잎을 첨가한 요쿠르트의 기호도가 무첨가구(6점)에 비하여 낮다는 것을 의미하므로 이를 보 완하기 위한 방안으로 본 연구에서는 유산균으로 발효시킨 뽕잎을 첨가하였다. 그 결과 요쿠르트들의 색은 건뽕잎 첨 가구(4.25점)에 비하여 발효뽕잎인 MLm 첨가구(5.50점)가 유의적으로 높았으며 그 외 다른 첨가구에서는 유의적인 차이가 없었다. 또한 신맛은 건뽕잎 첨가구(5.0점)에 비하 여 MLp 첨가구(5.5점)가 높아 신맛이 상대적으로 강한 것 으로 나타났고, 다른 첨가구에서는 유의적인 차이가 없었 다. 감칠맛과 쓴맛에 있어서는 건뽕잎 첨가구와 다른 발효 뽕잎 첨가구 간에 유의적 차이가 없었으나 전체적인 선호 도는 MLm 및 MLp 첨가구가 각각 5.5 및 5.75점으로 건 뽕잎 첨가구(4.0점)에 비하여 유의적으로 높았다. 하지만 스타터를 접종하지 않았던 공실험구도 동시에 유의적으로 높아 전체적 선호도에는 발효된 뽕잎과 함께 첨가된 배지 의 영향도 있는 것으로 예측되었지만 건뽕잎 대신 MLm, MLp 및 MLs와 같은 발효뽕잎을 식품소재로 사용하게 되 면 뽕잎을 첨가하지 않은 무첨가구 수준의 관능적 특성을 유지할 수 있을 것으로 예상되었다.
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식물유래 유산균 스타터에 의한 발효뽕잎의 DNJ 함량의 변화를 알아보기 위해 80% 에탄올로 각 시료를 추출한 후 HPLC로 분석을 하였다. 우선 DNJ 표준품으로 체류시간을 측정한 후(Fig. 3), DM과 Control, MLm, MLp, MLs의 추 출물의 DNJ 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같았다. 그 결과 뽕잎이 포함된 배지에 스타터를 접종하지 않은 control에 비하여 유산균으로 발효하여 얻은 발효뽕잎인 MLm, MLp, MLs에는 DNJ의 양이 약 10%까지 감소되었 음을 알 수 있었는데 이는 유산균 발효 중 생성되는 일부 효소 및 유기산에 의한 영향인 것으로 예상되었다.
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발효뽕잎 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 함량을 탄닌산 을 기준물질로 정량한 결과는 Table 4와 같았는데 총 폴리 페놀은 모든 발효뽕잎 추출물이 control에 비해 높은 함량 을 나타내었다. 이와 같이 발효뽕잎의 페놀성 화합물이 유 의적으로 증가한 것으로 나타나 뽕잎의 유산균 발효과정을 통하여 페놀성 화합물이 증가한 것으로 예측된다.
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발효뽕잎 추출물의 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Table 5와 같았다. 각 발효뽕잎 추출물의 플라보노이드 함 량은 control과 크게 차이가 없었다. Kwak (2007)은 시중 에 판매되는 뽕잎차 제품의 열수(80°C) 추출물의 플라보노 이드 함량은 20.95 mg/g라고 보고하였는데, 본 연구의 발 효뽕잎 추출물은 60 mg/g 수준으로 농축 정도에 따라 플라 보노이드 함량이 변화하므로 뽕잎차 제품 추출물에 비하여 약 2-3배 정도 플라보노이드가 농축되었음을 알 수 있었다.
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건뽕잎 추출물과 발효뽕잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거 능을 측정한 결과는 Table 6과 같았다. 발효뽕잎 추출물인 MLme, MLpe 및 MLse는 1,250 ppm 수준에서 아스코브산 15.6 ppm과 비슷한 수준의 라디칼 소거능을 보여주었으며 control에 비하여 근소하게 라디칼 소거능이 높은 것을 볼 수 있었다. 뽕잎의 유산균 발효에 의해 라디칼 소거능이 소폭 증가한 것을 볼 수 있었는데 이는 유산균 발효 생성 물인 유기산 등에 의해 라디칼 소거능이 증가한 것으로 예 측된다. Kim (2000)은 뽕나무 및 꾸지뽕나무 잎의 증류수 추출물이 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 보고하여 뽕 잎 추출물에 이미 항산화 성분이 존재하는 것을 예견할 수 있었다.
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발효뽕잎 추출물을 1 mg/mL의 수준으로 사용하여 α- glucosidase에 대한 저해활성을 검토한 결과를 Table 7에 나타내었다. 모든 추출물이 활성을 보였으며, 그 중에서도 MLp 추출물이 35.25%로 가장 높은 억제효과를 보였으며, MLm, MLs 추출물들도 각각 32.07, 29.96%의 저해활성을 나타내었다. 양성 대조구로 사용한 acarbose는 0.1 mg/mL 수준에서 54.58%로 발효뽕잎 추출물보다 높은 저해활성을 나타내었다. 이 결과는 페놀성 화합물 함량이 높을수록 항 산화 활성이 좋았던 결과와는 달리 α-glucosidase 저해활성 은 페놀성 화합물의 함량과 연관이 적음을 알 수 있었다. Ranilla et al. (2010)는 약용식물과 약초의 페놀함량과 항 산화활성의 상관관계(R2= 0.81)와는 달리, 항당뇨 활성(R2 = 0.39)과는 낮은 상관관계가 나타나 페놀성분이 직접적으 로 혈당 저하에 관여하지는 않는 것임을 시사하였다. 모든 발효뽕잎 추출물은 control에 비하여 α-glucosidase 저해활 성이 낮았는데 이는 발효뽕잎 추출물의 DNJ 함량이 모두 control에 비하여 낮은 것과 관련이 있는 것으로 예측되며 발효과정에서 DNJ가 생성되기 보다는 일부 분해되는 것으 로 예측된다. Fig. 4
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요 약
한방에서 해열, 소염 효능이 있는 소재로 알려져 있으나 쓴맛과 특이한 냄새로 사용이 제한적이었던 뽕잎을 3종의 김치유래 유산균으로 각각 발효한 후 식품소재로서 사용을 검토하였다. 그 결과 MLp (by L. plantarum), MLm (by Leu. mesenteroides), 및 MLs (by L. sakei)와 같은 발효뽕잎 을 얻었으며, 이들의 품질특성을 조사하였다. MLp 및 MLm 혹은 MLs와 같은 발효뽕잎을 첨가한 요쿠르트의 전 체적인 선호도는 건뽕잎을 넣은 요쿠르트에 비하여 높았으 며 발효뽕잎의 첨가가 요쿠르트의 기호도를 낮추지 않았다. 또한 발효뽕잎의 추출물은 대조구에 비하여 총 폴리페놀 함 량, 자유 라디칼 소거능은 증가하였으나 플라보노이드 함량 에서는 큰 변화가 없었다. 반면에 α-glucosidase 저해능은 대 조구에 비해 감소하였는데 이와 관련된 1-deoxynojirimycin 함량도 감소하는 경향을 보였다. 그럼에도 발효뽕잎은 뽕 잎의 특이한 풍미가 개선됨과 동시에 α-glucosidase 저해능 및 항산화성과 같은 건강지향적 품질특성을 유지함에 따라 식품소재로서 사용이 가능할 것으로 기대되었다.
