Article
효소처리에 따른 밀 배아 추출물의 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone과 수용성 아라비노자일란 함량 변화
이재강, 이정훈, 최용현, 최용석, 류기형1,*
Changes in 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone and Water Extractable Arabinoxylan Content of Wheat Germ Extract by Enzyme Treatment
Jae-Kang Lee, Jung-Hun Lee, Yong-Hyun Choi, Yong-Seok Choi, Gi-Hyung Ryu1,*
R&D Center, Sajodongaone Co., Ltd.
1Department of Food Science and Technology, Kongju National University
*Corresponding author: Gi-Hyung Ryu Department of Food Science and Technology, Kongju National University, Yesan, Chungnam 340-800, Korea Tel: +82-41-330-1484; Fax: +82-41-335-5944 E-mail:
ghryu@kongju.ac.kr
© Korean Society for Food Engineering. All rights reserved.
Received: Oct 16, 2018; Revised: Dec 24, 2018; Accepted: Jan 11, 2019
Abstract
This study was carried out using Celluclast 1.5L to increase the content of 2,6-DMBQ and water extractable arabinoxylan in wheat germ extract. Extraction temperatures were 30°C, 45°C and 60°C. The extraction times were 0, 6, 12, 18, 24 and 30 h. The pH of the extract decreased rapidly from 18 h at 30°C in both water- and enzyme-treated extracts. 2,6-DMBQ of water- and enzyme-treated extracts increased with the extraction time. At 30-hour extraction time, enzyme-treated extract increased 27.60% at 30°C extraction temperature than water extraction. Extraction temperatures of 45°C and 60°C were increased by 65.03% and 151.05%, respectively. The highest content of waterextractable arabinoxylan was 15.23±0.08 mg/g when the enzyme was treated at an extraction temperature of 60°C for 30 h. At 30=hour extraction time, enzyme-treated extract increased 7.92% at 30°C extraction temperature compared to water extraction. Extraction temperatures of 45°C and 60°C were increased by 31.20% and 54.38%, respectively.
Keywords: wheat germ; 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone; water-extractable arabinoxylan
서 론
밀 배아는 밀의 제분을 통하여 밀가루를 생산하는 과정 에서 부산물로 생산되며, 순수한 배아만을 분리하여 생산 된다. 밀 배아는 밀 전체 중량의 2-3%에 해당하며 밀가루 의 저장 수명과 가공 품질에 좋지 않은 영향을 미치기 때 문에 제분 시 제거된다(Rizzello et al., 2010). 배아는 25% 단백질과 8-13%의 지방을 함유하여 비타민E의 중요한 공 급원이며 무기질 함량이 4-5%으로 영양상 우수한 식품소 재이다(Zuzana et al., 2009). 밀 배아의 항염 기능성과 관 련하여 밀 배아 유가 LPS로 자극된 대식세포에서 염증과 관련된 인자들에 가해지는 영향을 살펴본 결과 NF-B 및 MAPKs의 신호 경로 조절을 통한 염증성 인자들의 발현 감소로 항염 효과를 나타낸다고 하였다(Kang et al., 2016a). 그러나 밀 배아는 높은 지방 함량으로 산패가 발생하여, 밀 배아의 안정성을 증가시키기 위하여 열, 마이크로웨이 브, 압출성형 처리 등이 제시되었으나(Paradiso et al., 2008) 가공비용 증가로 인하여 대부분 사료로 이용되고 있 으므로 부가가치 향상을 위한 가공방법의 개발이 필요한 실정이다.
Celluclast 1.5L은 Trichoderma reesei 곰팡이에서 유래된 셀룰레이스로, 셀룰로스를 포도당과 셀로비오스로 분해하 고, β-glucosidase 등 글리코시드 가수분해에 관여하는 효 소를 생산하는 것으로 졌다(Rosgaard et al., 2006;Seong et al., 2008;Claassen et al., 2000). Choi et al. (2018)은 밀 배아에 Celluclast 1.5L을 처리하여 30시간 추출 시 총 페놀함량과 총 플라보노이드 함량이 증가하였고, DPPH 라 디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능이 증가하여 항산화 활성을 나타냈다고 보고하였으며, Celluclast 1.5L은 주로 유기물을 가수분해 전처리 하여 발효 공정의 효율을 증가 시키기 위한 전처리에 주로 사용되고 있다(Ausiello et al., 2015).
2,6-Dimethoxy-1,4-benzoquinone (2,6-DMBQ)은 산화된 형태의 메톡시 하이드로퀴논으로, 올리고당에 연결되어 존 재한다(Hidvegi et al., 1999). 2,6-DMBQ는 밀 배아에 0.1 mg/g, 보리 배아에는 0.07 mg/g 들어 있는 것으로 보고되 었다(Tömösközi-farkas & Daood, 2004). 최근 밀 배아에서 퀴논화합물을 증가시키기 위하여 배당체로 존재하는 벤조 퀴논을 다양한 미생물로부터 기인되는 β-glucosidase로 분 리하여 생산하는 연구가 수행되었다(Yoo & Kim, 2010;Rizzllo et al., 2013). 이 퀴논 화합물은 항 증식성, 항 전 이성 및 면역학적 효과를 가지고 있는 것으로 알려졌으며 (Mueller et al., 2011), 밀 배아를 구연산 처리를 하여 2,6- DMBQ함량을 증가시킨 추출물로 항 염증 활성을 나타내 어(Kang et al., 2016b) 밀 배아의 2,6-DMBQ를 기능성 소 재로의 가능성을 제시하였다.
아라비노자일란은 밀의 세포벽을 구성하는 중요한 중합 체로 세포벽을 지지하는 역할을 하고 있다(Saulnier et al., 2007). 밀의 아라비노자일란의 기능성으로는 항염, 항암 및 알레르기 억제 효과가 있으며(Bae et al., 2004;Choi et al., 2017), 밀 배아에서 분리된 아라비노자일란의 면역세포 활성화 효과는 대식세포에서 분비되는 lysosomal enzyme 및 반응성 산소종의 생성과 연관이 있었다고 하였다(Choi et al., 2002). 최근 연구에 따르면 Celluclast 1.5L 효소 처 리 한 밀기울의 수용성 아라비노자일란의 함량이 0.32%에 서 7.14%로 크게 증가하였고, 대식세포의 활동을 증가시켜 항 염증 효과를 나타냈다고 보고하였다(Kang et al., 2016a). 밀 배아의 총 식이섬유 함량은 16.47 g/100g으로 알려져 있으나(Bansal & Sudha, 2011), 대부분의 연구가 비타민E에 집중되어 있으며 아라비노자일란 관련 연구는 미비한 실정이다.
본 연구는 밀 배아에 β-1,4 glucosidic linkage를 가수분 해하는 Celluclast 1.5L를 처리하여 추출 시간과 추출 온도 에 따르는 추출액의 pH 변화를 조사하고, 추출 건조물의 기능성 물질인 2,6-DMBQ및 수용성 아라비노자일란 함량 의 변화를 확인 하여 추출 공정의 효율성 확립을 목적으로 하였다.
재료 및 방법
실험재료
밀 배아 물 추출 건조물(water extract wheat germ, WEWG)과 Celluclast 1.5L 효소 처리 밀 배아 추출 건조물 (enzyme treated wheat germ, ETWG) 제조에 사용된 시료 는 밀 원맥을 제분하는 과정에서 부산물로 생산되는 밀 배 아(wheat germ, Sajo Dongaone Flour Mills Co., Dangjin, Korea)를 사용하였다. 추출에 사용된 효소는 Celluclast 1.5L (Celluclast 1.5L, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)를 사용하였다.
시료의 준비
밀 배아 50 g를 500 mL의 원심분리 튜브에 넣어준 다음 증류수 250 mL를 가하였다. 밀 배아 중량 대비 0.5%의 농 도로 Celluclast 1.5L 투입한 다음, 효소 활성 온도를 확인하 기 위하여 30°C, 45°C, 60°C로 설정된 항온수조(Maxturdy- 18, Daihan Scientific Co., Wonju, Korea)에서 각각의 추출 시간 동안 진탕 추출하였다. 추출이 종료된 직후 1,000×g 에서 15분간 원심분리(Union 5KR, Hanil Co., Incheon, Korea) 하였다. 원심 분리된 상등액을 여과지(Whatman 2, GE Healthcare, Little Chalfont, UK)를 사용하여 고형물을 제거하였다. 고형물이 제거된 상등액을 -70°C에서 6시간 동안 1차 동결 시킨 후 동결건조기(FD55, Ilshin Lab Co., Dongducheon, Korea)에서 -50°C까지 2차 감압 건조하여 분석용 동결건조 추출물을 제조하였다.
시료의 pH 측정
원심분리 후 여과된 추출액을 균질기(HG-15D, Daihan Scientific Co., Wonju, Korea)를 이용하여 3분간 균질화하였 으며, 균질화된 시료는 미리 보정된 pH 측정기(Model420, Thermo orion Co., Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정 하였다.
시료의 2,6-DMBQ 정량
WEWG와 ETWG의 2-MBQ와 2,6-DMBQ 정량 분석은 Yoo & Kim (2010)의 방법에 따라 측정하였다. 추출 건조 물 1 g을 증류수 50 mL에 용해시킨 후, 클로로포름(Merck Millipore Co., Darmstadt, Germany) 100 mL으로 3회 분획 하였다. 분획된 클로로포름을 감압 농축기(N-1000, Eyela Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 40°C에서 농축한 다음 20 mL의 HPLC 이동상 25 mM KH2PO4/acetonitrile (9:1, v/v, pH 4.8)으로 용해시켰다. 용해된 시료는 0.22 μm PTFE (Millex Simplicity, Merck Millipore Co., Carrigtwohill, Ireland)로 여과한 후 HPLC (Spectra System, Thermo electron Co., Waltham, MA, USA)로 분석하였다(Table 1). 분석용 컬럼은 Discovery Rp-amide C16 5 μm 250×4.6 mm (Supelco, Bellefonte, PA, USA)였다. 이동상의 유속은 0.7 mL/min으로 설정하였고, 컬럼의 온도는 70°C로 유지되 었다. 검출기는 자외선 검출기를 사용하였으며 290 nm로 분 석하였다. 정성 및 정량 분석 시 2,6-DMBQ (TCI Chemicals Co., Tokyo, Japan)를 표준물질로 사용하였다(Fig. 1).
Fig. 1.
HPLC Chromatogram of 2,6-DMBQ in wheat germ extract at water extract and enzyme-treated process.
(A) 2,6-DMBQ (standard); (B) Water extract wheat germ; (C) Enzyme treated wheat germ.
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수용성 아라비노자일란
수용성 아라비노자일란(water extractable arabinoxylan, WEAX) 정량은 Douglas (1981)의 방법에 따라 측정하였 다. 50 mL 튜브에 시료를 125 mg 담고, 증류수 25 mL을 첨가 후 1분간 교반 시킨 다음 시료 1 mL을 취하여 튜브 에 옮겼다. 현탁액 1 mL은 시료 5 mg에 해당한다. 시료를 30분간 교반 후 1,000×g에서 10분간 원심분리(Mega 17R, Hanil Co., Inchon, Korea) 하고 상등액 1 mL을 취하여 튜 브에 옮겨 시료를 준비하였다. 각 튜브에 1 mL의 증류수를 첨가 후 10 mL의 반응 용액(glacial acetic acid (110 mL) hydrochloric acid (2 mL), 20% phloroglucino in absolute ethanol (5 mL), 1.75% glucose (1 mL))을 넣고 혼합하였다. 25분간 끓는 물에 담가 두면서 10분 간격으로 격렬히 혼 합하여 주었다. 반응을 종결시키기 위하여 0°C의 물에 담 근 후 분광광도계(Libra S22, Biochrom Co., UK)를 이용 하여 552 nm에서 510 nm의 측정된 흡광 값을 빼준 뒤 자 일로스 표준곡선과 비교하여 수용성 아라비노자일란 함량 을 계산하였다. 자일로스 표준곡선은 10 mg D(+)xylose를 100 mL 증류수에 녹인 후 튜브에 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 mL 를 분주한 후 각 튜브에 증류수를 첨가하여 최종 2 mL로 맞추었다. 반응 용액을 10 mL씩 첨가하고, 끓는 물에 25분 간 담근 후 552 nm와 510 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 작성하였다. 수용성 아라비노자일란 함량은 3회 반 복 측정 후 평균값과 표준편차를 구하였다.
통계분석
WEWG와 ETWG의 분석 결과는 미니탭(Minitab17, Minitab Inc., University Park, PA, USA)을 이용하여 분산 분석(ANOVA)을 실시한 후 p<0.05 수준에서 평균 간 차이 에 대한 Tukey 동시 검정을 실시하였다.
결과 및 고찰
시료의 pH 변화
WEWG와 ETWG의 pH는 추출 온도 30°C와 45°C에서 추출 시간에 따라 감소하였으며, 추출 온도 60°C는 추출 시간이 경과해도 pH의 변화가 거의 없는 것으로 조사되었 다(Fig. 2). 밀 배아는 Lactobacillus rossiae와 같은 혼합 발효성의 젖산 생성균을 가지고 있다고 알려졌고, 이는 Lactobacillus plantarum과 함께 다양한 식품을 발효하기 위하여 사용되며, 밀 배아의 발효에 관여하여 항산화 활성 을 증가시킨다고 보고하였다(De Angelis et al., 2014;Scheirlinck et al., 2009;Rizzello et al., 2013). Shin et al. (2017)에 따르면 보리와 혼합한 밀의 발효 시 발효 온도 20-30°C에서 시간이 경과할수록 pH는 감소하였으며, 발효 시 생성되는 유기산은 대부분 citric acid와 lactic acid가 차지한다고 하였다. 일반적으로 구연산은 포도당이나 과당 을 Aspergillus niger의 수중 발효를 통하여 생산되며 (Crolla & Kennedy, 2001), 젖산은 Lactobacillus를 이용하 여 발효를 통해 생산된다(Leroy & Vuyst, 2004). 김치 발 효의 주요 젖산균을 가열 처리한 연구(Byun et al., 1989) 에 따르면 가열 온도 50°C에서는 가열시간에 비례하여 젖 산균의 감소가 확인되었고, 추출 온도 60°C에서는 가열 10 분 이내에 급격한 감소 후 시간에 비례하여 감소하였다고 보고하였다. 그러나 당 전이 반응을 위하여 55°C로 효소 처리를 한 연구 결과(Yong et al., 2012)에서 Celluclast 1.5L 은 50°C 이상에서 효소 안정성이 높다고 보고하여 Celluclast 1.5L의 활성도는 유지가 되었을 것으로 판단되 고, 추출물의 pH 변화는 밀 배아에 존재하는 유기산 생성 균의 영향을 받는 것으로 생각된다. 본 연구에서는 유기산 을 생산하는 젖산 생성 미생물이 추출 온도가 높아질수록 활성이 감소한 것으로 생각되며, 추출 시 생성되는 유기산 의 종류와 함량에 관하여 추가적인 연구가 필요하다.
Fig. 2.
Changes in pH of wheat germ extract at extraction time and extraction temperature.
(A) Water extract wheat germ; (B) Enzyme treated wheat germ. Values represent the mean±SD of three independent experiments. a-mMeans with the same letter in each sample are not significantly different at p<0.05.
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2,6-DMBQ 함량 변화
시료의 2,6-DMBQ함량을 HPLC로 분석한 결과 Fig. 1 과 같이 순수 분리되었으며, 그 피크의 면적으로부터 구한 함량은 Fig. 3과 같다. WEWG와 ETWG 모두 추출 시작 후 6시간까지 2,6-DMBQ가 거의 생성되지 않았으며, 12시 간 경과 후부터 증가하기 시작하였다. 추출 온도는 30°C 에서 가장 높은 함량의 2,6-DMBQ가 생산되었으며, 추출 온도가 올라갈수록 감소하는 경향을 나타냈다. 밀 배아에 는 젖산균이 존재하며(Rizzello et al., 2010) 젖산균은 β- glucosidase를 생산하는 것으로 알려졌다(Shim et al., 2014). 젖산균은 균주에 따라 다른 최적 온도와 pH를 가지고 있 으며(Jang & Kim, 2010), Zheng et al. (2016)은 밀 배아 내 배당체로 존재하는 2,6-DMBQ는 배아 세포 내 β- glucosidase에 의하여 하이드로퀴논 글루코시드가 아글리콘 으로 가수분해되고, peroxidase에 의하여 벤조퀴논으로 산 화되었다고 보고하였다. 본 연구에서는 30°C의 추출 온도 에서 젖산균이 생산하는 β-glucosidase의 효소 활성이 가장 활발하여 밀 배아에 배당체로 존재하는 2,6-DMBQ의 글리 코시드 결합이 절단되고 수용화되어, 건조물 내 함량이 높 게 측정되었으며, 온도가 증가할수록 효소 활성이 감소하 여 감소한 것으로 생각된다. Rizzello et al. (2013)은 β- glucosidase의 활성을 기준으로 Lactobacillus plantarum LB1과 Lactobacillus rossiae LB5를 선별하여 밀 배아 48 시간 동안 추출물을 제조한 결과 2,6-DMBQ의 함량이 0.252±0.013 mg/g의 으로 증가하였다고 하였다. 추출 온도 를 달리하였을 때 ETWG는 WEWG와 비교하여 추출 온 도가 30°C로 추출 시 2,6-DMBQ의 함량이 0.311±0.003 mg/g으로 약 27.60% 증가하였으며, 45°C 추출 시 0.190± 0.001 mg/g으로 65.03% 증가하였고, 60°C 추출 시 0.060± 0.003 mg/g으로 151.05% 증가하여 Celluclast 1.5L 처리가 2,6-DMBQ 수용화의 효율을 높여주는 것으로 나타났다 (Fig. 3). Lee et al. (2006) 등은 Celluclast 1.5L의 효소 활성을 위한 최적 pH는 4.5이고, 온도는 50°C 였다고 보 고하였다. 본 연구에서 추출온도 30°C와 45°C에서 추출시 간 18시간 후의 pH가 약 4.5였으며, 이때 WEWG 보다 ETWG의 2,6-DMBQ 함량이 증가하였으며, 젖산균의 활 성이 낮은 60°C에서도 WEWG 보다 높은 수율의 2,6- DMBQ 함량을 나타냈다. Celluclast 1.5L은 내부 β-1,4 결 합을 무작위로 절단하는 endo-1,4-β-D-glucanase, 말단의 셀룰로스에 작용하는 exo-1,4-β-D-glucanase, 셀로비오스를 가수분해하여 포도당을 유리시키는 β-glucosidase 등 셀룰 로스의 글리코시드 가수분해에 관여하는 효소를 생산한다 (Vinzant et al., 2001). 그리고 Lee et al. (2006)은 감태 줄 기 및 잎을 Celluclast 1.5L 처리하여 추출 시 50°C가 최적 온도였다고 보고하였다. 그러므로 Celluclast 1.5L 처리는 셀룰로스를 가수분해하고, 젖산균이 생산하는 β-glucosidase 가 밀 배아의 2,6-DMBQ 수용화를 용이하게 하는 형태로 만들어 주는 것으로 생각된다.
Fig. 3.
Changes in 2,6-DMBQ of wheat germ extract at extraction time and extraction temperature.
(A) Water extract wheat germ; (B) Enzyme treated wheat germ. Values represent the mean±SD of three independent experiments.Not detected atextraction time 0 h.
a-nMeans with the same letter in each sample are not significantly different at p<0.05.
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수용성 아라비노자일란 함량 변화
수용성 아라비노자일란 함량은 ETWG가 WEWG보다 증가하였다(Fig. 4). 특히 온도가 증가할수록 ETWG의 수 용성 아라비노자일란이 WEWG보다 최대 약 54.38% 증가 하는 경향을 나타내었다. 아라비노자일란은 밀 부산물로 얻을 수 있는 식이섬유의 한 종류로(Lu et al., 2000), 밀의 세포벽에 존재하는 헤미셀룰로스의 일종이다(Autio, 1996). Escarnot et al. (2011)은 밀기울의 아라비노자일란은 일부 수용화될 수 있다고 하였으며, Wang et al. (2014)에 의하 면 endo-1,4-β-xylanase를 밀기울에 처리하였을 때, 추출 온 도 50°C에서 가장 높은 수율의 아라비노자일란이 추출되었 고, 추출 시간이 증가함에 따라 수율이 증가하는 것으로 조사되었다. Kang et al. (2016b)이 보고한 압출성형된 밀 기울에 Celluclast 1.5L 처리를 한 경우 수용성 아라비노자 일란이 증가한 결과와 유사하였다. Celluclast 1.5L은 셀룰 로스를 포도당으로 가수분해 반응에 적용되는 효소이며 (Merino & Cherry., 2007), Sørensen et al. (2003)은 endo-1,4- β-xylanase와 Celluclast 1.5L과의 상호 작용으로 xylobiose와 xylotriose를 xylose로 가수분해한다고 하였으며, Liu et al. (2018)의 최근 연구에 따르면 Celluclast 1.5L이 셀룰로스 의 당화 과정 중 xylanase의 상승작용에 도움을 주었다고 보고하였다. 따라서 Celluclast 1.5L은 xylanase와 복합적 으로 밀 배아의 아라비노자일란 수용화에 작용한 것으로 생각된다.
Fig. 4.
Changes in WEAX of wheat germ extract at extraction time and extraction temperature.
(A) Water extract wheat germ; (B) Enzyme treated wheat germ. Values represent the mean±SD of three independent experiments. a-lMeans with the same letter in each sample are not significantly different at p<0.05.
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요 약
본 연구는 밀 배아의 기능성 물질인 2,6-DMBQ와 아라 비노자일란 추출 효율을 증가시키기 위하여 상업용 효소인 Celluclast 1.5L을 사용하여 추출하였다. 추출 시 온도는 30, 45, 60°C였고, 추출 시간은 0, 6, 12, 18, 24, 30시간 추출 후 상등액 pH 변화와 건조물을 분석하였다. 추출물의 pH는 WEWG와 ETWG 모두 추출 온도 30°C에서는 18시 간 추출 시부터 급격하게 감소하였으며, 45°C는 12시간부 터 감소하였고, 60°C는 다른 추출 온도와 비교하여 큰 변 화는 없었다. 2,6-DMBQ는 WEWG와 ETWG 모두 추출 시간이 경과함에 따라 증가하였다. 추출 온도 30°C에서 가 장 높은 함량으로 추출되었으며, 30시간 추출할 때 2,6- DMBQ 함량은 ETWG에서 WEWG 보다 추출 온도 30°C 에서 27.60%, 45°C에서 65.03%, 60°C에서 151.05% 증가 하였다. 수용성 아라비노자일란 함량은 WEWG와 비교하여 ETWG가 높게 측정되었으며, 효소 처리 후 60°C에서 15.23 ±0.08 mg/g으로 가장 높은 함량으로 나타났다. 30시간 추출 시 ETWG와 WEWG에서의 수용성 아라비노자일란 함량을 비교했을 때 30°C에서 7.92%, 45°C에서 31.20%, 60°C에서 54.38% 증가하였다. 본 연구 결과는 제분 부산물인 밀 배 아에 항염 활성을 보유하는 기능성 소재로서의 활용을 위 한 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
감사의 글
본 연구는 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획 평가원의 고부가가치 식품기술개발사업(과제번호: 116005- 3)의 지원에 의한 연구결과의 일부로 이에 감사 드립니다.
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