서 론
최근 우리나라에서는 평균수명의 연장, 초고령사회의 진 입, 생활수준의 향상 등에 따라 삶의 질에 대한 의식이 높 아지면서 웰빙이나 로하스(LOHAS, lifestyles of health and sustainability) 등과 같은 건강 지향적 사회 트랜드가 형성되었다. 이와 더불어 식생활의 서구화에 따른 생활습 관병의 증가로 건강기능식품에 대한 관심과 그 수요가 늘 어나고 있는 것이 현실이며, 이에 따라 국내 건강기능식품 개발 또한 2004년 건강기능식품에 관한 법률의 시행 이후 꾸준히 증가하고 있다.
계피는 녹나무과(Lauraceae)에 속하는 상록교목인 생달 나무(Cinnamomum japonicum SIEB)의 껍질을 그대로 또 는 외피를 제거하여 건조시킨 약초로서(Lin et al., 2016), 체질이 허약하고 기혈이 허한 사람을 위한 한방약재로 사 용되고 있으며, 위장병을 비롯한 여러 질병을 개선하는 것 으로 알려져 있다(Kim et al., 2006; Qin et al., 2010; Cao & Anderson, 2011). 또한 잎이나 껍질에서 얻은 계피의 가 루, 박편 또는 추출물은 향신료로서 식품에 첨가되거나 산 화 방지제 및 방부제와 같은 기능적 특성으로 식품에 첨가 될 수 있다(Lv et al., 2012; Settharaksa et al., 2012; Van Haute et al., 2016). 인도 및 스리랑카산 계피는 향긋하면서 달고 자극적인 맛이 강하여 향신료로 많이 사용되고 있고, 중국산은 한방 약재로 더 많이 사용되고 있다(Lewis et al., 1977). 계피의 성분으로 cinnamic aldehyde, cinnamic acid, flavonoid, tannin 등이 연구된 바 있다(Kya & Calista, 1969;Hiromu et al., 1974;Wijesekera et al., 1975;Inokuchi et al., 1984).
식품산업에서 압력을 수반하는 고압 또는 아임계 추출은 상전이(phase transition)를 수반함으로써 물질전달속도를 증 가시켜 세포 침투율 뿐만 아니라, 2차 대사물질의 확산을 증가시키기 때문에 천연 원료로부터 플라보노이드 등과 같 은 유용성분의 추출에 활용할 수 있다(Plaza et al., 2010;He et al., 2012). 전통적인 유기물의 추출방법에서 추출 속 도가 낮고, 추출 시간이 길며, 유독한 유기물이 남는 등의 문제를 해결하기 위한 대체 기술로서 아임계 추출방법의 적용에 대한 관심이 증가하고 있다(Khuwijitjaru et al., 2012). 생리활성 소재를 추출하기 위한 아임계 추출공정에 서 최적 추출조건은 대상 원료에 따라서 많은 차이를 보인 다. 적포도 껍질로부터 안토시아닌을 생산하는 아임계 추 출온도는 100-110°C가 적절하다고 하였으며(Corrals et al., 2008), 아마인(flaxseed)으로부터 페놀화합물인 lignan을 추 출하는 아임계 조건은 160°C, 5.2MPa이 최대 추출율을 보였다고 하였다(Kanmaz, 2014). 이외에 기능성 보리음료, 열대 약용식물로부터 생리활성 물질생산, canola meal로부 터 항산화 물질추출 등과 같은 적용 사례에 비추어 볼 때 아임계 추출기술은 식품산업에서 재래적인 추출공정을 대 체할 수 있는 효율적인 기술로 발전할 가능성이 크다고 볼 수 있다(Carr et al., 2011;Kadam et al., 2013).
본 연구에서는 항산화활성도가 높은 육계피 추출액을 얻 기 위해 추출방법이추출액의 특성에 미치는 영향을 파악하 고자 한 바, 에탄올 추출방법, 열수 추출방법, 그리고 아임 계 추출방법이 지표성분 및 항산화활성도에 미치는 영향을 분석하였다.
재료 및 방법
본 실험에서 사용한 육계피(Cinnamomum cassia blume) 는 국내산으로서 천호바이오로부터 제공 받아 실험에 사용 하였다. 항산화활성도 분석을 위해 사용한 시약들은 Sigma (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
일정량의 시료를 취해 상압가열건조법으로 105°C 건조기 에서 16시간 건조 후 데시케이터에서 30분간 방냉하여 수분 함량을 측정하였다(AOAC, 1990). Semi-micro Kjeldahl 법 을 이용하여 시료에 Se 혼합 촉매제와 95% 황산용액을 시 료에 첨가하여 플라스크가 완전히 투명해질 때까지 분해한 후 Tecator digestion 시스템(2006 digestor, Foss, Denmark)와 Kjeltec 자동 샘플 시스템(1035 analyzer, Foss, Denmark)를 이용하여 단백질 함량을 측정하였다. 도가니를 600°C 회화 로에서 1시간 가열하고 데시케이터에 옮겨 실온으로 냉각 시키고, 일정량의 시료를 취하여 도가니에 넣고 버너에서 약한 불로 탄화시킨 후 550°C 회화로에서 회색재가 될 때 까지 회화한 다음 회분함량을 측정하였다. Soxhlet 추출법 으로 EAM 9202-03 추출장치(Injae Science Co., Seoul, Korea)로 에테르를 용매로 16시간 추출한 후 에테르를 완 전히 증발시키고 105°C 건조기에서 2시간 건조시켜 방냉 한 후 지방함량을 측정하였다.
일반적인 열수 추출은 계피 시료를 100% 증류수와 에탄 올 70% 함유한 증류수를 용매로 첨가하여 교반하면서 상 압에서 180분간 진행하였다. 추출온도는 100% 증류수와 70% 에탄올 함유 증류수 용매의 경우 각각 95°C 와 80°C 이었다. 아임계 추출은 아임계 장치(TFS-3000, Inoway Co., Seoul, Korea)를 포함한 아임계 추출시스템을 이용하 여 분쇄된 30 g의 계피 시료에 증류수 300 mL를 첨가하 고 추출온도 110°C에서 압력 50 bar을 부가하면서 40 분 간 추출을 진행하였다. 각각의 추출물에 대한 추출조건은 Table 1에 나타내었다. 추출물은 4°C에서 11,000×g로 5분간 원심분리하여 종이필터(Watman No. 4, Maidstone, UK)로 여과하고 상등액을 일정부피가 되도록 적용하였다. 얻어진 상등액은 동결 건조하여 항산화활성도와 지표성분을 조사 하기 위한 분석 시료로 사용되었다.
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육계피 추출물의 향기성분으로 coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, cinnamyl alcohol 4가지를 HPLC (Agilent Technologies 1260 infinity, Palo Alto, CA, USA)를 통해 분석하였다. 분석용 컬럼은 ZORBAX Eclipse XDB-C18 (250 mm × 4 mm, 5 um, Agilent Technologies)을 사용하였 으며 이동상은 acetonitrile (A), 0.02% aqueous acetic acid (B)를 사용하였다. 이동상은 시간이 지남에 따라 (B) 용매가 90-50% (0-60 min), 50-90% (60-65 min), 90% (65-70 min) 로 1 mL/min으로 흘려주었다. 시료는 20 μL로 주입하였으 며 컬럼 온도는 20°C, 분석 검출은 280 nm (coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde), 250 nm (cinnamyl alcohol) 에서 진행하였다. Coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, cinnamylalcohol 표준시료를 메탄올에 녹여 1 mg/mL의 농 도로 제조한 후 0, 20, 40, 60, 80 μg/mL의 농도로 희석한 후 0.45 μm PVDF syringe filter (Sigma-Aldrich Co.)를 이 용해 여과한 후 분석에 사용하였다. 동결건조된 육계피 추 출물을 증류수에 녹여 1 mg/mL의 농도로 제조한 후 60 min 간 초음파처리를 한 후 0.45 μm PVDF syringe filter 를 이용해 여과한 후 분석에 사용하였다.
DPPH 측정법을 이용한 추출물의 항산화활성도 측정은 Llorach R et al. (2002) 방법을 참고하였다. 일정 농도로 준비된 추출물 100 μL에 80% 메탄올로 제작된 0.1 mM DPPH용액 2.9mL과 혼합한 후 상온에서 암실에서 반응시켰 다. 이후 UV spectrophotometer (V-550, Jasco, Tokyo, Japan) 를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 활 성비교를 위해 0-500 μg/mL 농도의 ascorbic acid 표준곡선 을 계산하였으며, DPPH scavenging activity (%)가 50%를 나타내는 시료의 농도를 저해농도(Inhibition concentration, IC50) 값으로 나타내었다.
FRAP 측정법을 이용한 추출물의 항산화활성도 측정은 Benaie et al. (1996)과 Dodonne et al. (2009) 방법을 참고 하였다. 일정 농도로 준비된 추출물 100 μL에 10:1:1의 비 율로 혼합된 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 10 mM TPTZ in 40 mM HCl용액과 20 mM FeCl3·6H2O 용액 300 μL를 혼합한 후 37°C에서 30분간 반응시킨 다음 UV spectrophotometer (V-550, Jasco, Tokyo, Japan)를 이용하여 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 황산화활성도 비교를 위해 0-100 μg/mL 농도의 ascorbic acid 표준곡선으로 계산 하였으며 mg AE/g dried sample로 나타냈었다.
결과 및 고찰
본 연구에서 사용 된 육계피의 일반적인 성분은 수분 10.86%, 조단백질 3.52%, 조 지방 2.22%, 조단백질 4.49%, 탄수화물 78.91% 이었다. 육계피의 일반적인 구성 요소는 일반 계피와 비슷한 구성을 가진 탄수화물로 주로 구성되 었다.
세 가지 추출조건으로 준비한 육계피 추출물의 향기 성 분인 coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, cinammyl alchol의 정량적 분석 결과는 Table 2에 나타내었다. 육계 피 추출물에서 coumarin의 함량은 건조시료 기준으로 12.08-22.81 mg/g의 범위를 나타냈으며, cinnamic acid의 함 량은 3.58-4.17 mg/g, cinnamaldehyde의 함량은 47.13-56.49 mg/g, cinnamyl alcohol의 함량은 1.76-2.56 mg/g의 범위를 나타냈다. 에탄올 70%의 추출물(CE-04)에서 Courmarin, cinnamic acid 그리고 cinnamylaldehyde의 함량은 열수추출 물(CE-03)과 아임계추출물(CE-05)에 비하여 유의적으로 높 게 나타났다(p<0.05). Prasad et al. (2009)은 에탄올 농도에 따라 플라보노이드와 페놀 화합물과 같은 생체 활성 화합 물의 중간 극성 및 극성에 미치는 영향이 다르기 때문에 추출 용매에서 적당한 에탄올 농도의 사용은 필요하다고 하였다. 추출용매로서 물보다 에탄올을 이용한 경우에 계 피 추출물의 cinnamyladehyde 함량(Nandam et al., 2012) 은 5에서 15 mg/mL으로 증가하였고, 70% 에탄올을 이용 한 경우에 페놀화합물의 총 함량(Kim et al., 1993)은 1.10 에서 1.24% 증가하였다. Kim et al. (2014)은 에탄올 농도 60% 이하에서 kirenol의 추출율이 동일하게 유지되지만, 에 탄올 농도가 60에서 100%로 증가하면 13.5배 감소하였다 고 보고했다. 또한, Durling et al. (2007)은 Salvia officinal 에서 추출한 페놀화합물의 높은 추출율은 55-75% 에탄올 용매를 사용하여 얻어졌다고 보고했다. 프로폴리스에 대한 고압 추출에서 75% 에탄올이 사용되었을 때, 높은 추출율 이 얻어졌다(Zhang & Wang, 2005). 추출용매로서 증류수를 사용한 경우, 아임계추출물(CE-05)의 courmarin, cinnamic acid, 그리고 cinnamaldehyde 함량은 열수추출물(CE-03)보 다 유의적으로 높게 나타났지만, cinnamyl alcohol은 반대 로 낮게 나타났다(p<0.05). Khuwijitjaru et al. (2012)는 메 탄올이 아임계 물을 이용한 추출보다 계피 껍질에서 향기 성분을 추출하는데 더 효과적이지만, 아임계 물을 이용한 추출 방법은 유기용매를 이용하여 계피 껍질에서 향기 성 분과 페놀 화합물의 추출을 위한 대체 방법이 될 수 있다 고 보고하였다.
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DPPH scavenging activity는 추출물의 농도가 증가할수 록 증가하였다(Fig. 1). 증류수를 이용한 열수추출물(CE- 03)이 아임계추출물(CE-05)보다 측정된 농도범위에서 높은 항산화활성도를 나타냈고, 농도가 증가함에 따라 항산화활 성도가 추출방법에 관계없이 완만하게 증가하였다. 그러나, 70% 에탄올 추출물(CE-04)의 항상화활성도는 농도가 1에 서 2 mg/mL으로 증가함에 따라 급격하게 55에서 88%로 증가하였지만, 농도가 4 mg/mL에서 96%가 된 이후 거의 일정한 수준으로 유지되었다. 70% 에탄올 추출물(CE-05) 은 농도 8 mg/mL 이전까지는 열수추출물(CE-03)과 아임계 추출물(CE-05)에 비하여 높은 항산화활성도를 나타냈지만, 그 이후는 유사한 값을 나타냈다. 이 결과를 통해 70% 에 탄올이 물보다 항산화물질을 추출하는데 보다 효율적인 것 으로 사료된다. Kim et al. (1993)은 계피 추출물의 항산화 활성도는 추출시간에 관계없이 용매를 물보다 70% 에탄올 을 사용했을 때 높았다고 보고하였다. 저해농도(IC50)은 DPPH scavenging activity 50%를 의미하며, 같은 항산화활 성도가 50%에 도달되기 위한 시료의 농도를 나타낸다. 저 해농도는 열수추출물(CE-03), 70% 에탄올 추출물(CE-04), 그리고 아임계추출물(CE-05)에서 각각 2.94, 0.89, 그리고 3.87 mg/mL이었다(Table 3).
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FRAP 분석을 통한 열수추출물(CE-03), 70% 에탄올 추 출물(CE-04), 그리고아임계추출물(CE-05)의 아스코브산 (ascorbic acid) 농도는 각각 81.10, 220.44, 그리고 82.37 mg/g (dried sample)이었다(Table 2). DPPH scavenging activity에서와 마찬가지로 70% 에탄올 추출물(CE-04)의 항 산화활성도가 월등히 크게 나타났고, 열수추출물(CE-03)과 아임계추출물(CE-05)은 유사한 결과를 보였다. Fig. 2
요 약
건강 지향적인 사회 추세의 영향으로 건강 기능 식품의 관심과 개발이 증가되고 있다. 계피는 기능적 특성으로 인 해 한약뿐만 아니라 식품 성분으로도 사용되고 있어서 본 연구에서는 추출용매와 추출방법을 달리하여 육계피 추출 액의 향기 성분과 항산화활성도를 조사하였다. 육계피 추출 물의 향기 성분인 coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, cinnamyl alcohol의 함량을 조사하였다. 에탄올 70%의 추출 물에서 courmarin, cinnamic acid 그리고 cinnamylaldehyde 의 함량은 증류수를 이용한 열수추출물과 아임계추출물에 비하여 높게 나타났다. 증류수를 이용한 아임계추출물의 courmarin, cinnamic acid, 그리고 cinnamaldehyde 함량은 열수추출물보다 높게 나타났지만, cinnamyl alcohol은 반대 로 낮게 나타났다. DPPH 분석을 통한 항산화활성도 측정 에서 DPPH scavenging activity는 추출물의 농도가 증가할 수록 증가하였고, 70% 에탄올 추출물의 항산화활성도가 가장 크게 나타났다. FRAP 분석을 통한 항산화활성도 측 정에서 70% 에탄올 추출물의 ascorbic acid 함량이 가장 크게 나타났고, 열수추출물과 아임계추출물은 유의적인 차 이가 없었다(p<0.05).
