서 론
인삼은 동양에서 효능이 인정된 약용식물로 인삼의 구성 성분인 사포닌 성분과 비 사포닌 성분인 페놀, 플라보노이 드, 산성다당체 등의 효과가 널리 알려져 있다(Lee et al., 2000; Yoo et al., 2000; Kim & Kim, 2005). 또한 인삼의 생리활성은 체계적인 약리학적 접근으로 심혈관계, 면역계, 신경계에 대한 효능과 해독작용, 항암작용 그리고 항당뇨 작용 등이 잘 알려져 있다(Kim et al., 2007; Kang et al., 2008). 한편 산양삼(cultivated wild Panax ginseng, CWPG) 은 일반적인 인삼과는 다르게 산지에 산삼의 종자나 인삼 의 종자를 파종하고 인의적인 비료나 농약을 사용하지 않 고 방임하여 재배하고, 일반적으로 인삼에 비하여 약리적 인 활성이 높고 향이 강한 특징을 갖는다고 알려져 있으며, 형태적 차이로는 인삼에 비하여 가늘며 긴 지근을 가지며, 몸통에 여러 층의 둥그런 띠 형태를 갖는다(Bae et al., 2009). 이러한 산양삼의 ginsenoside 및 항산화능에 대한 연구는 소수의 연구자에 의하여 진행되어 왔으며(Pan et al., 2013), 이들의 연근에 따른 ginsenoside, 항산화능 및 산성다당체의 변화에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
Free radical의 위험성은 1954년 산소의 유해성이 최초로 제기된 이후(Gerschman et al., 1954), 1969년 ROS 등의 개념이 추가 되었고(McCord & Fridovich, 1969), 현재에 와서는 이러한 free radical이 각종 질병과 노화의 원인으로 알려지게 되었다(Valko et al., 2007). Free radical은 항산화 제의 고갈 및 단백질 구조의 변화 등의 문제를 일으키기 때문에 이들을 효과적으로 제거하는 것이 중요하다. 산양 삼의 경우 인삼보다 항산화 활성이 매우 높다고 보고되어 있지만(Jang et al., 2008), 이들의 연근에 따른 항산화활성 의 변화는 보고된 바 없다. 또한 인삼의 비 사포닌 성분 중에 하나인 산성다당체 성분은 대식세포에 면역 증강 효 과를 가지고 있으며 이러한 능력이 암과 같은 질병의 치료 를 위해 임상 적으로 사용될 수 있다고 알려져 있고(Shin et al., 2004), 대식세포의 기능적 활성화를 통한 면역 자극 치료제로 사용될 수 있다고 하였다(Byeon et al., 2012). 최근 산성다당체의 효능과 효과에 대한 연구가 많이 진행 되고 있으나 산양삼의 연근에 따른 산성다당체의 변화에 대한 연구는 전무한 상황이다. 따라서 본 연구에서는 산양 삼의 연근별 일반성분, 조사포닌 함량, 진세노사이드 성분, 항산화 효과 및 산성다당체 함량의 변화를 연구하여 이들 산양삼을 식품 또는 건강기능식품으로 산업화하는데 밑거 름이 될 수 있는 기본적인 자료를 제공하고자 하였다.
재료 및 방법
본 연구에 사용된 평창산 산양삼은 3년근, 5년근, 7년근을 농업회사법인 ㈜우리두(Pyeongchang, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 산양삼은 흐르는 수돗물로 3회 수세 후 증류 수로 최종 수세하고, paper towel이 깔린 테이블에서 표면 을 건조한 후 -20°C 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였 다. 추출에 사용된 용매는 주정용 에탄올을 사용하였고, 조 사포닌 분석은 시약용 diethyl ether와 n-butanol은 Daejung Chemicals & Metals Co. Ltd. (Siheung, Korea)의 것을 사용하였다. HPLC 분석에는 HPLC grade의 acetonitrile과 water는 Daejung Chemicals & Metals Co. Ltd.의 것을 사용하였다. NaNO2, AlCl3, NaCO3, Folin-Ciocalteu 용액, DPPH (α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl), AAPH (2,2'-azobis- (2-amidinopropane) dihydrochloride)와 ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), galacturonic acid, ascorbic acid, gallic acid, catechin, phosphate-buffered saline (PBS) 등의 시약은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 의 것을 사용하였다.
각각의 산양삼 시료를 원물기준 3년근 500 g (고형분 약 109.8 g), 5년근 200 g (고형분 약 51.0 g), 7년근 200 g (고 형분 약 56.8 g)에 70% 주정용 에탄올(Ethanol Supplies World Co. Ltd., Jeonju, Korea)을 25배 가한 뒤, 70°C에서 24시간동안 환류 냉각 추출기(Glass Extractor JS980, Jung Sung Hascom, Seoul, Korea)를 이용하여 추출하였다. 또한 상온 추출은 시료를 환류 추출방법과 같은 용매비율인 1:25 로 설정하고 시료를 분쇄하여 상온에서 30분간 교반 하여 추출하였다.
추출된 시료는 Kimble-filtering flask에 funnel을 장착하 고 번 filter paper (Whatman No. 2)를 사용하여 추출물을 여과한 뒤 여과액을 미리 항량된 수기에 넣어 50°C의 수 온에서 감압회전농축기(N-11 Eyela, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 감압 농축 하고, 추출물의 일부를 105°C의 열풍건조기(HB-502M, Hanbeak Scientific Co., Bucheon, Korea)에서 건조하여 (1)번 식을 이용하여 추출 수율을 계산하였다.
일반성분은 Association of Official Analytical Chemists (AOAC)법을 따라 분석하였다(AOAC, 2002). 수분함량은 105°C dry oven에서 24시간 건조하여 측정하였으며, 조지방 은 soxhlet 추출법으로(Soxtec 243, Foss Korea, Sungnam, Korea), 질소함량은 digester (MBCM12, Raypa, Barcelona, Spain), distiller (DNP1500, Raypa) 및 titrator (Akkudiver, Hirschmann Laborgerate, Eberstadt, Germany)를 이용하여 semi-micro Kjeldahl법으로 측정하였다. 조회분은 550°C 회화법을 이용하여 분석하였다.
시료의 조사포닌 함량분석은 Ando et al. (1971)와 Namba et al. (1974)의 방법을 일부 수정하여 측정하였다. 농축액 에서 시료 2 g에 해당하는 추출액과 증류수 25 mL을 분액 깔때기에 넣고 diethyl ether 25 mL을 더한 다음 시료가 골 고루 섞이도록 잘 흔들어준 후 물 층과 에테르 층으로 분 리 될 때까지 방치시켰다. 분리된 에테르 층은 버리고 남 아있는 물 층에 다시 수포화 부탄올 25 mL을 더하여 다시 잘 흔들어준 후 분리 될 때까지 방치시켰다. 분리된 수포 화 부탄올 층은 따로 모으고, 물 층에 다시 수포화 부탄올 을 더하는 과정을 3번 반복하였다. 분리된 수포화 부탄올 에 물 50 mL를 넣고 잘 흔들어 준 후 다시 층 분리될 때 까지 방치시킨 후 수포화부탄올 층을 감압회전농축기(N-11 Eyela, Tokyo Rikakikai Co. Ltd.)를 사용하여 미리 항량된 수기에 넣고 감압 농축하였다. 감압 농축 후 105°C dry oven에서 2시간 건조하고 항량시킨 후 무게를 측정하여 (2)식을 이용하여 조사포닌 함량을 계산하였다.
Ginsenoside 함량은 조사포닌을 HPLC grade 메탄올에 용해한 후 0.45 μm syringe filter를 이용하여 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 본 실험에 사용된 HPLC (Agilent 1260, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)의 조건은 Table 1과 같다. 칼럼은 Kinetex사의 C18 (50 × 4.6 mm, ID 2.6 μm, Torrance, CA, USA)을 사용하였 고, 검출기(G1314F, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)는 UV detector로 203 nm에서 측정하였다. 이동 상으로는 증류수(A)와 acetonitrile (B)의 gradient system을 사용하였고, gradient는 Table 1에서 제시된 비율로 조절하 였다. 이동상의 유속은 1.0 μL/min이었으며, 시료 주입량은 5 μL, 분석온도는 45°C로 하였다. Ginsenoside 표준품은 Rg1, Re, Rf, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg, Compound K, Rh2를 사용하였다.
| Time (min) | H2O | Acetonitrile |
|---|---|---|
| 0-6 | 82 | 18 |
| 6-11 | 74 | 21 |
| 11-15 | 68.5 | 31.5 |
| 15-25 | 66.1 | 33.9 |
| 25-26.5 | 60 | 40 |
| 26.5-29 | 44 | 56 |
| 29-31 | 30 | 70 |
| 31-32.5 | 15 | 85 |
| 32.5-34.5 | 15 | 85 |
| 34.5-35.5 | 82 | 18 |
| 35.5-40 | 82 | 18 |
산성다당체 함량 분석은 Do et al. (1994)의 방법인 carbazole-sulfuric acid 방법을 이용하여 비색정량 하였다. 산양삼 추출물 0.05 mL에 에탄올에 녹인 0.01% carbazole 용액 0.25 mL과 H2SO4 3 mL을 넣은 후 80°C 항온수조 (EYELA SB-1100, Tokyo Rikakikai Co. Ltd.)에서 반응시 킨 후 상온에서 15분간 냉각시켜 주었다. 반응 후 분광광 도계(UV-1200, Labentech, Incheon, Korea)를 이용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였고 대조구로는 증류수를 사 용하였다. 표준물질로는 galacturonic acid를 사용하였다.
총 페놀 함량(Total Phenolics, TP)는 Folin-Ciocalteu 방 법을 변형하여 측정하였다(Singleton et al., 1999). 시료 10 μL와 증류수 100 μL를 혼합한 후 Folin-Ciocalteu 용액 10 μL를 섞은 후 6분간 반응시켰다. 그 후 7% Na2CO3 80 μL를 넣고 실온에서 90분간 반응 시킨 뒤 750 nm에서 96 well microplate reader (iMark, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 표준물질로 하여 표준곡선 구하였고, mg gallic acid equivalent (GAE)/100 g sample로 표기하였다
총 플라보노이드 함량(Total Flavonoids, TF)는 Zhishen et al. (1999)의 방법을 이용하여 측정하였다. 희석한 시료 17 μL와 증류수 96 μL를 혼합한 후 2.5% NaNO2 10 μL를 넣고 섞어주었다. 5% AlCl3 10 μL를 넣고 1M Na2CO3 67 μL 넣어 균질화 한 후, 510 nm에서 96 well microplate reader (iMark, Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Catechin을 표준물질로 하여 표준곡선 구하였 고, mg catechin equivalent (CE)/100 g sample으로 표기하 였다.
시료의 항산화능은 DPPH free radical scavenging activity (Brand-Williams et al., 1995)와 ABTS radical scavenging activity (Kim et al., 2003)의 방법을 변형하여 측정하였다. 80% Methanol을 사용하여 0.1 mM DPPH 용액을 제조하 고 DPPH 용액과 시료를 섞어 30분간 실온에서 반응시킨 후 510 nm에서 96 well microplate reader (iMark, Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거능의 경우 1.0 mM AAPH (2,2'-azobis-(2-amidinopropane) dihydrochloride)와 2.5mM ABTS (2,2'-azino-bis-(3- ethylbenzothiazoline-6-sulphnic acid)를 PBS와 혼합하여 70°C 에서 반응 시킨 후 0.2 μm syringe filter로 여과한 후 ABTS 시약과 시료를 37°C에서 10분 동안 반응시켰다. 흡광도는 96 well microplate reader (iMark, Bio-Rad Laboratories) 를 이용하여 750 nm에서 측정하였다. DPPH 및 ABTS radical 소거능 활성의 표준 물질은 vitamin C를 사용하였 고, mg vitamin C equivalent (VCE)/100 g sample로 표기 하였다.
결과 및 고찰
연근별 산양삼의 모습을 Fig. 1에 나타내었다. 3년근 산 양삼 뿌리의 길이와 폭은 동체가 작고 잔뿌리의 수가 대체 로 적었으며, 5년근과 7년근 산양삼에 비하여 눈에 띄게 작았다. 5년근과 7년근의 경우, 동체의 둘레 길이가 차이 가 났으며 잔뿌리의 수 역시 7년근에서 많이 나타났다. 인 삼은 2년생까지는 주로 길이로 성장하고, 4년생 이후부터 는 지근이 발달하면서 주근과 함께 측면으로 비대해져 근 직경이 커지기 시작한다. 6년근에 가서는 비로소 지근과 주근의 균형이 맞추어 지는 것으로 알려져 있다(Han et al., 2013a). 산양삼의 경우 인삼에 비하여 상대적으로 낮은 생장속도를 나타내는 것으로 알려져 있는데, 그 이유는 인 삼은 생장 조건을 최적화하여 재배하지만 산양삼의 경우 그렇지 않기 때문에 조건이 부적합한 경우 생장이 더딘 경 향이 있다.
연근별 산양삼의 일반성분 분석결과를 Table 2에 나타내 었다. 연령이 증가함에 따라 수분함량이 낮아졌지만, 조지 방과 조단백질의 함량은 증가 하였다. 조지방과 조단백 질 함량은 7년근에서 가장 높게 나타났고 뒤를 이어 5년 근, 3년근 순으로 나타났으며, 3년근과 5년근간의 유의적 (p<0.05) 차이는 없는 것으로 나타났다. 회분 함량은 연근 에 따라 유의적(p<0.05) 차이가 나타나지 않았다. 이는 인 삼이 성장하면서 인삼의 동체중심부 즉 목부가 비후되고, 동시에 단백질 생합성량도 함께 증가되어 조단백질 함량이 증가한다는 결과(Yang et al. 2006)와 유사한 경향을 나타 내었다.
연근별 산양삼을 환류 추출 했을 때의 추출 수율은 Table 2와 같다. 추출 수율은 5년근에서 가장 높았고, 7년 근, 3년근 순으로 나타났다. 조사포닌 함량의 경우 3년근과 5년근의 유의차(p<0.05)는 없었고 7년근의 조사포닌 함량이 상대적으로 낮게 나타났다. 산양삼의 추출 수율과 조사포닌 함량은 연근에 따라 상관관계를 가지지 않는 것으로 나타 났다. 조사포닌 함량이 연령이 증가함에 따라 감소하는 것 은 사포닌 성분이 낮은 연령근에서 가장 많이 생합성이 이 루어 지기 때문이며, 연령이 증가하면서 중량이 증가하는 것에 비례하지 않고 인삼 사포닌이 크게 증가 하지 않기 때문에 이러한 변화가 나타난다고 보고(Lee et al., 2004)와 일치하는 결과를 나타내었다. 또한 인삼의 직경이 증가 할 수록 목질부의 부피가 피층보다 크기 때문에 ginsenoside 함량은 감소하고(Li et al., 2009), 근 직경이 작을수록 ginsenoside 함량이 증가한다고 보고(Han et al., 2013b)된 바 있다.
산양삼의 연근별 ginsenoside profile과 함량을 각각 Fig. 2 및 Table 3에 나타내었다. Fig. 2의 ginsenoside profile은 연근에 따라 큰 차이가 나타나지 않는 것으로 분석되었으 며, 본 연구에서 분석한 ginsenoside는 총 11종으로 모든 ginsenoside들이 분석되지 않았으며, Table 4에 명시된 total ginsenoside는 분석된 11종의 ginsenoside 함량의 합을 나 타낸다. Total ginsenoside는 7년근, 3년근 및 5년근 순으 로 높은 것으로 나타났다. 특이적으로 compound K와 Rh2는 인삼에서는 발견되지 않고 산삼에만 미량 검출되는 ginsenoside로 알려져 있는데, 7년근에서 Rh2만 발견되지 않았고 나머지 시료에서는 모두 검출되었다. Fig. 2에서 볼 수 있듯이 7년근의 경우 HPLC chromatogram에서는 Rh2 의 peak이 미세하게 나타났지만 정량적으로 분석될만한 양 이 아니기 때문에 검출되지 않은 것이라 판단된다. 이런 결과는 어린 연근에서 사포닌합성이 활발히 일어나고 연근 의 증가함에 따라 부피의 증가가 우세하게 발생함에 따라 중량대비 compound K와 Rh2의 함량이 낮아졌기 때문으로 생각된다(Lee et al., 2004).
추출방법에 따른 추출 수율, 조사포닌 함량 및 ginsenoside 차이를 알아보기 위해 3년근 산양삼을 이용하여 환류추출 과 상온추출과의 차이를 비교하였다. 산양삼의 추출방법에 따른 추출 수율과 조사포닌 함량을 Table 4에 나타내었다. 환류 추출한 산양삼의 추출 수율이 38.29%로 나타났고, 상온 추출한 산양삼의 추출 수율은 이보다 유의적(p<0.05) 으로 낮은 24.16%로 나타났다. 이러한 차이는 환류 추출 의 경우 상온추출에 비하여 장시간 동안 진행되기 때문인 것으로 판단된다. 또한 추출과정에서 환류 추출은 비교적 높은 온도에서 이루어지는 반면 상온추출은 낮은 온도에 서 이루어지기 때문에 환류 추출의 경우 열에 의해 많은 성분들이 용매로 이행이 되기 때문에 더 높은 추출 수율 을 나타냈을 것으로 생각된다. 조사포닌 함량 역시 환류 추출한 3년근 산양삼에서 78.57 mg/g dried ginseng로 상온 추출한 3년근 산양삼 67.60 mg/g dried ginseng 보다 유의 적(p<0.05)으로 높은 함량을 나타냈다.
| Extraction yield (%) | Crude saponin contents (mg/g dried ginseng) | |
|---|---|---|
| HRE2) | 38.29±0.17a1) | 78.57±3.25a |
| RTE3) | 24.16±0.24b | 67.60±8.43b |
산양삼의 추출방법에 따른 ginsenoside 함량을 Table 5에 나타내었다. Ginsenoside 함량도 추출 수율과 조사포닌 함 량과 마찬가지로 compound K를 제외한 모든 ginsenoside 함량이 환류 추출한 산양삼에서 높게 나타났다. 환류 추출 은 인삼의 최적의 추출방법으로 알려져 있다. 환류 추출은 비교적 높은 온도에서 장시간 이루어지는 반면 상온추출은 낮은 온도에서 짧은 시간 동안 진행하였기 때문에 환류 추 출의 경우 많은 성분들이 용매로 이행되어 ginsenoside 함 량이 높은 것으로 판단된다. 흥미로운 것은 compound K 의 경우 상온 추출에서 유의적으로 높은 값이 나타나 상온 추출에 적합한 것으로 보이는 반면 Rh2는 상온 추출한 산 양삼의 경우 검출이 되지 않아 ginseoside들이 추출 방법에 따라 달라지는 것을 확인할 수 있었으며 이에 대한 보완 연구가 더 필요할 것으로 판단된다.
연근별 산양삼의 산성다당체의 함량, 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 각각 Table 6에 나타내었다. 산성 다당체의 경우 3년근에서 가장 높은 값인 531.09±6.07 mg galacturonic acid/g dry ginseng로 나타났고 5년근에서 251.03±0.61 mg galacturonic acid/g dry ginseng, 7년근에 서 153.41±0.28 mg galacturonic acid/g dry ginseng로 연 근에 따라 큰 폭으로 줄어든다는 것을 확인 할 수 있었다. 저연근 일수록 건조 중량 당 산성다당체의 양이 많은 것은 다당체성분의 생합성량이 부피 성장보다 커서 단위 중량당 산성다당체의 양이 많은 것 때문으로 생각된다.
총 페놀 함량의 경우 3년근은 62.60±0.91 mg GAE/100 g으로 가장 높은 값을 나타내었으며 5년근 및 7년근보다 유의적(p<0.05)으로 큰 값을 나타내었다. 총 플라보노이드 함량도 총 페놀 함량과 마찬가지로 3년근이 18.77±1.02 mg CE/100 g으로 가장 높은 값을 나타내었으며 5년근 및 7년 근보다 유의적(p<0.05)으로 큰 값을 나타내었다. 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 모두 건조무게로 환산 하였 을 때 그 차이는 더욱 커지는 것으로 나타났는데, 그 이유 는 3년근의 경우 수분함량이 5, 7년근에 비하여 높기 때문 인 것으로 판단된다.
연근별 산양삼의 DPPH radical 소거능및 ABTS radical 소거능도 TPC와 TFC와 마찬가지로 3년근이 17.21±0.27 mg VCE/100 g 및 41.90±1.64 mg VCE/100 g로 가장 높게 나 타났으며, 이를 건조 산양삼 기준으로 환산하였을 때 그 차이는 더욱 커졌다. 3년근 산양삼의 경우 원물과 건조물 로 볼 때 항산화능에서 5년근, 7년근보다 유의적(p<0.05)으 로 큰 값을 나타내어 3년근 산양삼으로도 충분한 항산화능 을 발휘할 수 있음을 확인하였다.
요 약
산양삼의 연근별 특징을 분석한 결과 3년근에서는 ginsenoside 등의 성분이 활발하게 생성되고, 연령이 늘어 갈 수록 부피 성장이 중점적으로 일어나는 것으로 나타났 다. 또한 산성다당체 함량, 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 항산화능 모두 3년근 산양삼이 다른 연근보다 유 의적(p<0.05)으로 높은 결과 값을 나타내었다. 결과적으로 3년근의 경우 단위 중량당 더 많은 양의 성분들을 가지고 있으므로 파종 후 장기간 재배보다는 단시간에 수확하는 것이 재배를 하는 임업인이나 제품을 개발하는 기업인 모 두에게 유리 할 것으로 판단된다. 따라서 ginsenoside의 함 량 및 다른 생리활성 성분들의 양으로 연근별 산양삼의 특 징을 비교 할 경우 비록 부피는 작지만 가격이 싸고 개체 수가 많은 3년근을 이용하여 제품을 개발하는 것이 산업적 으로 이득이 될 수 있을 것으로 판단된다. 본 연구의 결과 는 평창산 산양삼에 한정된 항산화 결과로서 국내 다른 지 역에서 자생하는 연근별 산양삼에 대한 세부적인 기능성 연구가 추가적으로 필요한다.
