증숙 및 발효한 천문동의 항균활성과 특성

천문동은 전라도 고창의 천문농원에서 17년근을 구입하였 다. 구입한 천문동은 세척 후 동결건조(FD5510S-FD5520S, Ilshinbiobase Co., Dongduchon, korea)하여 증숙 처리하 였다. 증숙 처리 조건은 추출기(Extractor, Dongnam Co., Daejeon, Korea)를 통해 95°C에서 12시간 동안 증숙한 후 50°C에서 24시간 동안 열풍 건조(JSOF-150, JS Resarch Co., Gongju, Korea)하여 50 mesh 이하로 분쇄(MF-3100S, Hanil Electric Co., Seoul, Korea)한 후 사용하였다.

천문동의 발효 및 항균활성 측정에 사용한 균주는 본 실 험실에서 분리한 균주와 한국미생물보전센터(KCCM)에서 분양받은 균주를 사용하였다. 천문동의 발효에는 본 실험 실에서 분리한 Leuconostoc mesenteroids 4395 (Kim et al., 2011), Lactobacillus sakei 383 (Kim et al., 2011) 그 리고 Lactobacillus plantarum KCCM 11322를 MRS broth (Difco, San Jose, CA, USA)에 배양하여 실험에 사용하였 다. 또한 항균활성 측정에는 호흡기 질환과 관련이 있는 것으로 알려진 균주를 사용하였다. 그람 양성균으로는 만 성 부비동염에서 발견되는 Staphylococcus aureus KCCM 40881과 상악동염에서 발견되는 Staphylococcus epidermidis KCCM 35494이, 그람 음성균으로는 폐렴의 원인균으로 알 려진 Pseudomonas aeruginosa KCCM 11328과 호흡기 질 환 환자의 객담에서 나타난 Escherichia coli KCCM 11234을 실험에 사용하였다(Shin et al., 1991; Sohn, 1997; Chung et al., 2006; Kim et al., 2013). 항균활성 측정에 사용된 균주는 Muller Hinton broth (Difco)와 Triptic Soy broth (Difco) 로 배양하여 실험에 사용하였다.

증숙 처리 후 분쇄한 천문동 분말 37.5 g에 증류수 250 mL를 가하여 121°C에서 20분간 멸균하였다. 젖산균은 30°C에서 계대 배양을 2회 한 후 650 nm에서 흡광도가 1.0일 때 멸균된 천문동에 각각 5% (v/v) 씩 접종하였다. 접종된 천문동은 30°C에서 48시간 동안 발효하였다.

증숙 처리한 천문동의 추출물은 증숙 처리한 천문동 분 말 50 g에 에틸아세테이트 500 mL를 가하여 추출하였다. 발효한 증숙 천문동의 추출물은 250 mL의 에틸아세테이트 를 가하여 추출하였다. 각각의 추출은 진탕 항온수조에서 50°C, 110 rpm으로 24시간씩 총 3회 이루어졌다. 추출물은 여과(Whatman filter paper No. 2) 후 농축을 통해 일정농 도로 조절하여 실험에 사용하였다.

항균활성은 agar well diffusion method를 변형하여 측 정하였다(Ahmad & Beg, 2001). 각각의 균주들은 35°C에 서 2회 계대 배양한 후 600 nm에서 흡광도가 0.4일 때 Muller Hinton broth Agar (0.8% agar)에 1%씩 접종한 후 petri dish에 20 mL씩 분주하였다. Plate가 실온에서 응고되 면 pasteur pipette을 이용하여 6 mm 직경의 well을 만든 후 추출용매인 negative control과 일정 농도의 추출물을 70 μL 주입하였다. 35°C에서 일정시간 배양한 plate는 well 주위의 생장 저해환의 직경(mm)을 측정하여 비교하였으며 이어지는 모든 실험은 3회 반복한 결과를 평균과 표준편차 로 나타내었다.

증숙 후 발효한 천문동 추출물의 최소저해농도(Minimum inhibitory concentration)는 항균활성 측정과 동일한 방법으 로 측정하였다. 추출물을 일정 농도로 조성하여 well에 70 μL씩 주입한 후 35°C에서 일정시간 배양하여 생장 저해환 의 직경이 8 mm 이상을 최소저해농도로 정하였다(Choe & Kang, 2014; Yoo et al., 2005).

증숙한 천문동 분말 17.25 g을 증류수 125mL에 첨가하 여 121°C에서 20분간 멸균한 후 젖산균을 각각 5% (v/v) 씩 접종하여 30°C에서 발효하였다. 접종 후 0, 12, 24, 36, 48, 72, 96시간마다 pH와 산도를 측정하였다. 산도는 발효 한 증숙 천문동 10 mL에 증류수를 10 mL 혼합한 후 0.1 N NaOH로 pH 8.3이 될 때까지 적정하여 측정하였다. 적 정에 사용된 0.1 N NaOH 양을 다음과 같은 식을 통하여 젖산의 산도로 계산하였다.

$\begin{array}{l}\text{Acidity (\%)}\\ \text{=}\frac{\begin{array}{c}\text{0.009×Consumption of 0.1 N NaOH (mL)}\\ \text{×\hspace{0.17em}Factor×Dillution rate}\end{array}}{\text{Volume of sampe (mL)}}\text{×100}\end{array}$

증숙 후 발효한 천문동의 수분함량은 105°C 상압가열건 조법, 조회분은 직접회화법(AOAC, 1995)을 통하여 측정하 였다.

총당은 동결건조한 시료 0.2 g에 증류수 9 mL와 25% HCl 1 mL를 첨가하여 2시간 동안 95°C에서 산분해시킨 후 여과(Whatman filter paper No. 2)하였다. 각 여액 0.5 mL 에 5% phenol 0.5 mL와 진한 황산 2.5 mL를 가하여 15분 간 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

환원당은 동결건조한 시료 4 g에 증류수 100 mL를 가한 후 30°C, 120 rpm으로 2시간 동안 교반하였다. 교반이 끝난 시료는 10% trichloroacetic acid (v/v)를 소량 첨가한 후 15 분간 정치하여 단백질을 침전시켜 여과(Whatman filter paper No. 2)하였다. 각 여액 0.5 mL에 3,5-dinitrosalicylic acid 시약을 1.5 mL 넣고 90°C에서 10분간 수욕시킨 후 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복하여 결 과를 평균과 표준편차로 표기하였다.

증숙 후 젖산균으로 발효한 천문동의 에틸아세테이트 추 출물의 항균활성을 Table 1에 나타내었다. 추출물 농도 25 mg/mL에서도 본 실험에 사용된 모든 호흡기 질환 관련 미생물에 대해 생장 저해환을 확인할 수 있었다. 천문동을 증숙하지 않고 젖산균으로 발효한 선행 연구에서 천문동 추 출물의 경우 25 mg/mL 농도에서 S. aureus와 P. aeruginosa 에 대한 항균활성이 나타나지 않았으나 증숙 후 발효한 천 문동 추출물의 경우 생장 저해환이 나타났으며 특히 P. aeruginosa에 대해 가장 높은 항균활성을 나타내었다(Fig. 1). S. epidermidis의 경우 100 mg/mL 농도에서 ESAM이 18 mm 직경의 생장 저해환을 나타내 다른 젖산 발효 추출 물의 14.17-15.33 mm에 비해 높은 항균활성을 나타냈다. 본 실험 결과에서 천문동은 증숙 후 발효를 하였을 때 항 균활성이 개선된 것으로 나타났으며 이는 증숙을 통해 항 균활성이 있는 것으로 보고된 폴리페놀과 플라보노이드의 함량이 증가되었기 때문인 것으로 판단된다(Alvarez-Suarez et al., 2010; Lee et al., 2013). 유사 실험에서 도라지의 증 숙을 통해 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 증가하였으 며 항균활성 또한 개선된 것으로 보고된 바 있다(Lee et al., 2013; Kim et al., 2016).

Fig. 1. Antimicrobial activities of ethyl acetate extracts of A. cochinchinenesis steamed and fermented with lactic acid bacteria. A: Antimicrobial activity of ESAM, B: Antimicrobial activity of ESAP, Concentration of the 25, 50, 100 mg/mL.

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증숙 후 젖산균으로 발효한 천문동의 에틸아세테이트 추 출물의 최소저해농도를 측정하였다(Table 2). 실험에 사용 한 모든 젖산균 발효 천문동 추출물이 10 mg/mL의 추출물 농도에서 직경 8 mm 이상의 생장 저해환을 나타냈으며 P. aeruginosa는 5 mg/mL의 추출물 농도에서 각각 8.33-8.58 mm 직경의 생장 저해환을 나타내었다. 선행 연구에서 ESAM과 같은 젖산균으로 발효한 천문동 에틸아세테이트 추출물의 경우, E. coli에 대한 최소저해농도가 25 mg/mL 였으나 증숙 후 발효하였을 때 최소저해농도가 10 mg/mL 로 낮아진 것으로 나타났다.

증숙 후 발효한 천문동의 pH와 산도는 Fig. 2에서 나타 내었다. L. mesenteroides 4395와 L. sakei 383은 접종 후 12시간이 되었을 때 pH 3.55-3.58까지 감소한 뒤 96시간 까지 큰 변화가 없었으나 L. plantarum KCCM 11322의 경우 24시간이 되서야 pH 3.58로 감소하였다. 산도의 경 우 L. mesenteroides 4395가 접종 후 12시간이 되었을 때 2.20±0.05%로 L. plantarum KCCM 11322의 1.57±0.05% 보다 높은 산도를 나타내었다.

Fig. 2. pH and acidity of A. cochinchinensis steamed and fermented with lactic acid bacteria. ●: pH, ▲: Acidity, A: Steamed A. cochinchinenesis fermented with L. mesenteroides 4395, B: Steamed A. cochinchinenesis fermented with L. sakei 383, C: Stea1med A. cochinchinenesis fermented with L. plantarum KCCM 11322.

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증숙 후 발효한 천문동의 수분 및 회분 함량은 Table 3 를 통하여 나타내었다. 발효한 증숙 천문동의 수분 함량은 86.28-86.43%로 발효 전 보다 약 5% 내외 정도 감소한 것 으로 나타났다. 조회분 함량은 0.89-0.92%로 발효 전과 후 가 큰 차이를 나타내지 않았다.

증숙 후 발효한 천문동의 총당 및 환원당 분석 결과는 Table 4로 나타내었다. 증숙 처리 후 총당이 863.33 mg/ mL에서 722.67 mg/mL로 감소하였으며 발효 후 301.50- 361.42 mg/mL로 감소하였다. 환원당은 증숙 처리 후 99.36 mg/mL에서 109.29 mg/mL로 증가하였으며 발효 후 27.39- 62.20 mg/mL로 감소하였다. 총당의 경우 우엉의 증건을 반 복하였을 때 함량의 감소가 나타났다는 연구 결과가 있으 며 이는 수용성 당이 수증기를 통해 유출되어 손실된 것으 로 판단된다(Lee et al., 2015). 환원당의 경우 수삼의 증건 을 반복하였을 때 초기에는 환원당이 증가하다 이후 감소 하였다는 보고가 있으며 발효 후 총당과 환원당의 감소는 김치의 발효 과정에서 당이 감소한다는 보고가 있어 젖산 균의 생육과 대사산물의 생성에 당이 사용된 것으로 생각 된다(Song & Kim, 1991; Hong et al., 2007). 천문동은 본 래 달고 쓴맛을 지녔다고 알려졌으나 증숙 후 발효를 통해 당의 감소와 젖산의 증가가 일어나 쓴맛과 신맛이 부각되 었다(Shin et al., 2010). 증숙한 천문동의 발효액을 제품화 할 경우 제품소비의 확대를 위해 맛을 조절 할 필요가 있 다고 판단된다(Kim et al., 2014).