에탄올을 활용한 무정형입자감자녹말(Amorphous Granular Potato Starch) 제조방법 최적화

실험재료는 (주)뚜레반(Seoul, Korea)에서 생산한 감자녹 말을 사용하였으며, 실험 전까지 4°C에서 냉장 보관 하면 서 사용하였다.

에탄올 함량과 온도 범위는 예비실험을 통하여 에탄올 함량 10-90% (10% 간격으로 총 9개)를 100°C에서 가열을 하였을 때 녹말입자가 가장 잘 보존되며 복굴절성은 많이 사라지는 조건으로 에탄올 함량 48-62%를 선정하였고, 온 도는 먼저 선정한 에탄올 함량범위로 온도 100°C에서 가 열하였을 때 녹말입자가 예상보다 많이 손실되는 것을 확인 하고 88-96°C로 낮추어 선정하였다. 시간 범위는 예비 실험 과 동일한 20분으로 잡아주었다. RSM은 central composite design (CCD)으로 녹말입자 손실을 최소화하고 복굴절성은 사라지게 할 수 있는 최적 조건을 목적으로 디자인하였다. 변수인 에탄올 함량(X₁)과 온도(X₂)에 따라 중심점 55% 및 92.5°C를 기점으로 범위를 Table 1처럼 나타내었다.

감자녹말 10 g (dry basis, d.b)을 에탄올 용액(48-62%) 100 mL에 각각 잘 분산시켜 준 뒤, 88-96oC로 설정된 water bath에 넣어 20분간 교반시키며 중탕하였다. 에탄올 의 끓는점은 78°C이기 때문에 88-96°C로 가열 시 에탄올의 손실이 발생한다. 에탄올의 손실을 최소화 하기 위해 50 mL conical tube에 시료를 넣고 뚜껑을 닫은 후 parafilm으 로 틈을 막은 상태로 중탕하였다. 중탕이 끝나자마자 겔 형성을 방지하기 위해 무수에탄올 50 mL을 첨가하여 탈수 시킨 뒤 원심분리 하였다. 원심분리 조건은 3,000 rpm의 속도로 4°C에서 5분간 하였으며 이러한 과정을 3번 반복 하였다. 탈수된 감자녹말은 40°C 드라이오븐에서 24시간 건조하여 분쇄한 후 100 mesh 체로 쳐서 통과한 것을 시 료로 사용하였다.

모델 적용은 녹말 입자 관찰의 실험 데이터를 바탕으로 식 (1)을 이용하여 독립변수인 에탄올 함량(X₁)과 온도(X₂) 에 따른 모델 적용을 위한 값들을 구하였다.

여기서 Y는 2개의 종속변수인 granule integrity와 birefringence 결과이고, β₀는 절편, β_i, β_ii 그리고 β_ij는 linear, quadratic, interaction에서 각각의 model coefficient를 나타 낸다.

녹말 입자모양은 시료를 증류수에 분산시켜 광학현미경 (CX31RTSF, Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 이용 하여 40배율로 관찰하였고, 편광렌즈를 이용하여 복굴절 현상을 확인하였다.

전분의 호화 중 열적 특성을 알아보기 위해 밀봉된 빈 pan을 reference로 하여 Differential Scanning Calorimeter (DSC 4000, Perkin Elmar Inc., Waltham, MA, USA)를 사 용하여 측정하였다. 일반 감자녹말과 최적 조건으로 처리 된 AGPS로 수분함량 75% (wet basis, w.b)의 현탁액을 제 조하였다. 녹말 현탁액 20 mg을 aluminum pan에 넣고 1시 간 동안 실온에서 방치하여 안정화시켜 준 다음 25°C에서 1분간 유지한 후 25°C에서 120°C까지 5°C/min으로 가열하 여 열적 특성 곡선을 얻었다.

X-선 회절도는 X-ray diffractometer (D8 Advance, Bruker AXS GmbH, Karlsruhe, Germany)에 의해 Cu-Kα 을 X-ray 원으로 하여 40 kV와 300 mA의 조건에서 0.02° 2θ 회절간격으로 5-40°까지 3°/min으로 X-ray diffraction pattern을 조사하였다.

Design Expert software (Version 7.0, Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 반응표면분석을 수행 하였다. 통계분석은 ANOVA를 이용하여 분석을 하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 측정한 다음 SAS (version 9.1.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 통계 프로그램 을 이용하여 5% 유의수준에서 Duncan's multiple range test 로 평균간의 다중비교를 실시하였다.

실험디자인은 Table 2와 같이 중심점인 에탄올함량 55%, 가열온도 92°C을 3반복으로 하여 총 11회에 걸쳐 진 행하였으며, 결과 값은 광학 현미경을 이용하여 분석한 녹 말입자의 보존 정도와 복굴절성의 손실 정도를 5점 척도법 을 사용하여 녹말입자모양을 잘 유지하고 복굴절성을 많이 손실이 된 경우 5점으로 평가하였다.

모델 적용 결과 종속변수에서 quadratic 모델이 선정되었 다(Table 3). 모델의 적합성은 일반적으로 p-value에 의해 결정되는데, 실험 진행이 원활하게 이루어졌다면 p<0.05의 값을 나타낸다. 본 연구의 결과에서는 녹말입자모양과 복 굴절성의 p-value가 가열온도의 경우 0.0272, 0.0296 값을 나타내어 quadratic 모델이 적합하다는 것을 확인할 수 있 었다. 따라서 모델 적용에 있어서 적합하다고 판단된 2개 의 종속변수 녹말입자모양과 복굴절성에 대하여 ANOVA 분석을 실시하였다.

11개의 실험디자인대로 실험한 녹말입자를 현미경으로 관찰한 결과는 Fig. 1과 같다. 에탄올 함량이 가장 낮은 46.5%의 경우 상대적으로 수분함량이 많아져 호화가 많이 진행되었으며, 그 결과 복굴절성이 가장 많이 사라진 것을 확인 할 수 있었다. 55%의 에탄올 함량으로 처리된 감자 녹말들은 가열온도에 따른 차이가 크게 나지 않아 비슷한 입자모양과 복굴절성을 보였다. 60%대 에탄올 함량을 가 진 감자녹말의 경우에는 에탄올 함량이 높아 완전하게 호 화가 진행되지 않아 복굴절성이 많이 소실되지 않았다. 하 지만 녹말의 입자모양은 부피가 약간 커졌을 뿐 찌그러진 곳 없이 형태를 잘 유지하는 것을 확인 할 수 있었다. 최적 조건으로 처리한 무정형입자감자녹말(Amorphous Granular Potato Starch, AGPS)를 Fig. 2에 나타내었다. 녹말 입자모 양은 일반감자녹말 입자모양과 비교했을 때 크기가 조금 커졌을 뿐, 형태는 그대로 유지 되고 있고 복굴절성은 완 전히 사라진 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 1. Light (1) and polarized (2) micrographs of amorphous granular potato starches treated at 88.3-96.2°C with 46.5-62.4% EtOH (46.5%-92°C: A, 50%-90°C: B, 50%-95°C: C, 55%-88.3°C: D, 55%-92.5°C: E, 55%-92.5°C: F, 55%-92.5°C: G, 55%-96.2°C: H, 60%- 90°C: I, 60%-95°C: J, 62.4%-92°C: K).

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Fig. 2. Light and polarized micrographs amorphous granular potato starch treated at 94°C with 53% EtOH (LM: A, PM: B).

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고온과 수분에 의한 감자녹말의 호화가 일어날 때, 감자 녹말의 팽윤이 동시에 일어난다. 감자녹말이 팽윤될 때, 녹 말 분자 결정체에 장력이 가해져 결정체가 일그러지는 경 향이 있다. 이로 인해 이중나선이 풀리고 분리되어, 결국 결정영역이 붕괴되고, 배열이 망가진다. 감자녹말 내부에서 는 amylose와 amylopectin이 뒤얽혀 감자녹말의 입자모양 을 유지하고 있다(Yan & Zhengbiao, 2010).

에탄올 처리법은 녹말 표면에 변화를 가져오는데, 옥수 수와 타피오카의 경우 녹말 입자표면에 주름이 생겼고, 감 자의 경우에는 크랙이 생성되었다고 하였으며, 이러한 녹 말 입자표면의 변화는 아마도 녹말의 분자 구조 차이에 기 인한 것이라 보고하였다(Zhang et al., 2012).

감자녹말을 팽윤시키기 위한 수분과 열, 팽윤을 막기 위 한 알코올을 포함하는 에탄올 용액에 의해 녹말은 입자 모 양은 유지하되, 복굴절성을 소실하게 된다. 즉, 호화를 촉 진하고 팽윤을 저지하기 위한 두 힘이 동등할 때, 수분과 열에 의한 호화와 알코올의 팽윤 억제에 의해 AGPS가 얻 어진다.

모델적용이 적합한 2개의 종속변수 입자모양과 복굴절성 에 대하여 ANOVA로 분석한 결과를 Table 4에 나타내었 다. 2개의 종속변수 모두 95%의 신뢰도로 모델적용에 있 어 유의적 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다. Linear term에서 에탄올 함량에는 입자모양과 복굴절성 모두 95% 의 신뢰도로 유의적 차이를 보였다. 그러나 온도에 있어서 는 2개의 종속변수 모두 유의적 차이를 보이지 않았다. 또 한 interaction term에서 있어서도 2개의 종속변수 모두 유 의적 차이를 보이지 않았다. Quadratic term에서도 linear term과 마찬가지로 입자모양과 복굴절성 모두 에탄올 함량 에 있어서 95%의 신뢰도로 유의적 차이를 보였으며, 온도 에 있어서도 2개의 종속변수 모두 유의적 차이를 보이지 않았다. 따라서 2개의 종속변수 모두 온도보다는 에탄올 함량에 더 큰 영향을 받는다고 볼 수 있다.

입자모양과 복굴절성에 따른 반응표면분석 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 최적 조건을 contour plot으로 표기 하였 고 그 최적화 정도의 척도로 desirability를 사용하였다. Desirability는 52.5-54% 에탄올함량과 92.5-95°C의 가열온 도에서 가장 높은 값을 보이는 것을 확인 할 수 있었다. Liu et al. (2010)은 옥수수녹말로 50% 에탄올을 이용하여 AGPS를 제조하였고, 감자전분과 유사한 조건으로 AGPS 를 제조할 수 있음을 알 수 있었다. 한편 일정 온도에서 에탄올 함량이 증가할수록 감자녹말의 입자모양이 잘 유지 가 되지만 AGPS는 복굴절성이 소실되어야하기 때문에 종 속변수의 점수에서 낮은 점수를 나타내었다. 따라서 최대 의 desirability는 반복 연산도중 계산되어, 여러 결과들 사 이에 최적화 된 한 값에 수렴하며 이 값은 0.987로 측정 되었고, 최적 조건은 에탄올 함량 53.3%, 온도는 93.87°C 로 선정 되었다(Table 5).

Fig. 3. 3D response surface of amorphous granular potato starch for desirability.

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일반감자녹말과 AGPS의 열역학적 특성을 알아보기 위해 DSC분석을 실시하였고, 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 일 반감자녹말의 그래프를 보면 57°C에서 72°C사이에 녹말이 호화될 때 피크가 나타나는 것을 볼 수 있다. 하지만 AGPS의 그래프에서는 피크가 나타나지 않아 이미 호화가 진행되어 내부의 결정영역이 파괴된 것을 알 수 있었다. Fig. 5.

Fig. 4. DSC thermograms of native potato starch and amorphous granular potato starch.

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Fig. 5. X-ray diffraction patterns of native potato potato starch and amorphous granular potato starch.

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일반감자녹말의 경우 결정형태는 B-type의 패턴을 보이 며 7°, 17°, 22°, 24°에서 피크가 나타났다. 하지만 AGPS의 경우 7°, 17°, 22°, 24°에서의 피크는 사라졌고, 13° 부근에 서 새로운 피크를 보였다. 또한, 무정형녹말(amorphous granular starch, AGS)에서 관찰할 수 있는 V-type 패턴 형 태와 유사한 완만한 곡선을 보였다. Jane et al. (1986)은 V-type 회절에 기여하는 것이 amylose, amylopectin 및 지 방족 알코올 복합체(complexes)라고 보고하였다. Benshan et al. (2012)는 에탄올 용액을 이용하여 고온처리 한 감자 녹말 같은 B-polymorphic 녹말들은 옥수수나 타피오카 녹 말과 같은 A-polymorphic 녹말보다 더 약한 피크를 나타낸 다고 보고하였다. 옥수수 녹말과 비교했을 때, 감자 녹말에 서는 V-type 회절이 더 약하게 나타났으며, 이는 녹말 입자 의 amylose와 amylopectin 분자의 결합 정도의 차이에 의 한 것으로 보인다 Zobel (1984)은 amylose와 amylopectin 분자들이 옥수수 녹말에서는 대체로 분리되어있으나, 감자 녹말의 경우에는 더 밀접하게 연결되어 있다고 보고하였다. 따라서 일반 감자 녹말과 AGPS의 회절패턴을 비교하였을 때, 결정형태가 B-type 패턴에서 V-type 패턴으로 바뀐 것 으로 보아 AGPS는 호화가 진행되어 결정영역이 파괴되었 다는 것을 확인 할 수 있었다.