입자도와 초고압 처리에 따른 더덕의 외피와 육질의 항산화 활성

본 실험에 사용된 더덕은 횡성 도매시장에서 구매하였으 며 수세가 완료된 원물을 사용하였다. 열풍 건조 후 분쇄 한 더덕 외피와 더덕 육질을 나누어 채를 이용하여 20-40 mesh, 40-60 mesh, 100 mesh 이하의 시료로 나눈 뒤 1:40 (5 g:200 mL)의 비율로 더덕 샘플과 증류수를 섞은 후 일 반 60°C에서 6시간동안 추출하였다.

초고압 추출은 더덕 샘플과 증류수를 섞은 상태로 진공 포장을 진행하여 초고압추출장치(Ilshin autoclave Co. Ltd., Daejeon, South Korea)를 이용하여, 각 추출 조건에 따라 각 처리 조건에 따라 10, 30분 동안 250, 450MPa에서 초고압 처리를 한 후 추출을 시행하였다. 추출 후 감압여과장치로 여과하여 농축, 동결건조를 한 후 실험에 사용하였다. 추출 후 동결 건조한 시료 0.1 g을 dimethyl sulfoxide (DMSO; Junsei Chemical Co., Ltd, Tokyo, Japan)를 이용하여 용액 화한 후 sonicator에서 30°C에서 30분간 처리한 뒤 0.45 μm 주사기용 여과 필터(Whatman, Clifton, NJ, PA, USA) 를 이용하여 처리하였다.

동결 건조한 시료의 총 phenol 함량을 측정하기 위해 Folin-Danis법을 사용하였다(Park et al., 2007). 시료를 DMSO에 10 mg/mL 농도로 용해시킨 뒤 96 well plate에 시료액 10 μL와 증류수와 1:9의 비율로 희석시킨 Folin & Ciocalteu’s phenol reagent 100 μL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 혼합한 뒤 5분간 상온에서 반응시킨 뒤, 20% sodium carbonate 용액 100 μL (Yukari Pure Chemicals Co., LTD, Tokyo, Japan)를 혼합하여 암실에서 2시간 반응 시킨 후 Microplate Reader (iMark^TM Microplate Reader Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하 여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 gallic acid (Sigma-Aldrich)를 이용하여 표준곡선에 따른 검량선 을 작성하여 총 phenol 함량을 계산하였다.

동결 건조한 시료의 환원력을 측정하기 위해서 Park et al. (2007)의 실험법을 이용해서 측정하였다. 시료 0.5 mL 와 1% potassium ferricyanide 0.5 mL (Sigma-Aldrich)를 넣 고 50°C에서 20분간 반응을 시켰다. 반응시킨 용액을 10% trichloracetic acid (TCA) 용액 0.5 mL (Sigma-Aldrich)를 가한 후 2,000 rpm에서 15분간 원심분리를 진행하였다. 상 층액 1 mL에 증류수 0.5 mL와 0.1% ferric chloride 0.5 mL (Sigma-Aldrich)를 혼합 하여 700 nm에서 흡광도를 측 정하였다(Oyaizu, 1986).

동결 건조한 시료의 항산화 활성을 확인하기 위해서 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다. 시료 40 μL와 0.0004M DPPH시약 160 μL를 1:4의 비율로 96 well plate에서 반응시킨 뒤 30분간 방치 한 후 Microplate Reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하고 식 (1)과 같이 계산하였다.

이후 추출물의 전자공여능 값을 50% 감소시키는 IC₅₀ (half maximal inhibitory concentration)을 구하여 평가하였 다(Yen & Chen, 1995).

더덕, 외피 그리고 육질 시료의 건조 후 분쇄한 입자 체 망을 통과하는 물질크기의 기준인 mesh 별로 SEM (Scanning electron microscope, E-1010, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다. 시료는 전처리 없이 Au-Pd coating을 실시한 뒤 이미지를 측정하였다. 배율은 100배, 500배, 1,000배로 측정하였다.

실험결과는 Excel 2013 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA)을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준편차를 계 산하였다. 실험군 간의 비교는 분산분석(ANOVA)을 이용 하여 실행하였고 Duncan’s multiple range test를 이용, 시 료간 유의성을 p<0.05와 p<0.1의 수준에서 검정하였다. 모 든 실험은 3회 반복을 하였다.

본 실험에 사용한 더덕을 외피와 육질로 분리하여 총 phenol 함량을 입자도 별로 측정하였다(Fig. 1). 더덕을 외 피와 육질로 분리하지 않은 상태로 건조 후 분쇄 시 입자 도가 감소할수록 총 phenol 함량은 감소하였다. 일반적으 로 추출물의 양은 외부저항이 적을 경우 확산법칙에 따라 식(2)와 같이 표현된다(Geankoplis, 2003).

N_A은 용액에 용해되고 있는 A의 kg mol/s, A는 입자의 표면적(m2), k_L은 물질전달 계수(m/s), C_AS는 용질 A의 포 화용해도(kg mol/m³), C_A는 t (s)시간 후의 용액내의 용질 A의 농도(kg mol/m³)이다. 일정한 비율의 용매와 용질이 동일한 온도에서 추출 될 경우 입자의 크기가 줄어들 경우 상대적으로 용매와 접촉하는 표면적의 크기가 증가하여 추 출 속도와 추출되는 성분의 양이 증가하게 된다. Fig. 1의 결과는 식 (2)에서 나타난 일반적인 확산법칙과 상이한 결 과이다.

동일한 건조 상태에서 동일한 분쇄조건으로 분쇄 시 경 도가 높은 부분이 낮은 부분에 비하여 상대적으로 입자의 크기가 높게 나타난다(Dziki, 2011). 이는 더덕을 외피와 육질을 분리하지 않고 분쇄 시 입자도가 낮은 부분(20-40 mesh)에 경도가 상대적으로 높은 외피 부분이 많이 분포되 어 있음을 의미한다. 이같이 동일한 입자 크기 내에 외피 와 육질의 비율의 차이가 있어 이에 따라 총 phenol 함량 에 차이가 날 수 있다는 가설 하에 건조 전 내피와 육질 을 분리하여 건조 후 입자도별로 총 phenol 함량을 측정하 였다(Fig. 1).

Fig. 1. Changes in total phenol concentration of deodeok, deodeok flesh and deodeok skin by different particle size. Values for a given fraction sharing the same superscript are not significantly different at p<0.1.

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식물 기원의 시료에서 페놀 화합물은 함량이 많을수록 항산화 활성이 높아(Duval & Shetty, 2001), 항산화 활성 의 지표로서 사용된다. 외피부위에서 측정한 총 phenol 함 량은 육질 부위와 비교 시 입자도에 관계없이 2.5배 이상 높은 수치를 보여주었다. 이와 같은 결과는 Kang (2009)에 서 나타난 세포벽 물질을 통한 육질과 외피의 항산화 활성 비교와 유사한 결과로 확인 할 수 있다. 반면 육질부위는 입자도가 감소할수록 총 phenol 함량이 증가하여 표면적의 증가에 따른 추출 수율이 증가되는 전형적인 외부저항이 작은 경우의 확산에 따른 추출 수율의 변화를 보여주었다. 외피의 경우 입자도에 따른 총 phenol 함량에는 유의 차(p <0.1)가 없음을 보여 주었다. 이는 총 phenol 함량의 경우 외피의 보다 강한 외부저항에 의하여 입자도에 따른 확산 현상을 나타내지 않음을 추론할 수 있다.

더덕의 내피를 사용하여 초고압 처리시간을 10분과 30 분으로 변화 할 시 처리 시간에 따른 총 phenol 함량을 측 정하였다(Fig. 2). 초고압 처리 시 각 입자도 별로 초고압 처리를 하지 않은 내피의 총 phenol 함량(Fig. 1)과 비교 시 2에서 2.8배 이상의 증가를 가져왔다. 반면 초고압 처리 시간을 10분에서 30분으로 연장 시 두 실험 군간에는 유의 차(p<0.1)가 없는 것으로 나타났다. 이는 Jun et al. (2009) 에서 녹차 잎의 초고압 추출 시 시간에 따른 유의 차가 나타나지 않은 것과 유사한 결과로 볼 수 있으며, 일정 시 간 이상이 되면 추출 시간을 늘릴 필요가 없음을 시사한다. 마황과 당귀의 항암활성 증진에서도 초고압 추출 시간이 일정 수준 이상이 되면 시간에 따른 유의 차가 나타나지 않는 현상과 유사한 현상으로 확인할 수 있으며(Jeong et al., 2009), 또한 초고압 처리(250 MPa)에 의하여 내부 저 항이 급격히 감소하여 총 phenol 성분의 추출을 증가시킨 것으로 추정된다. 그리고 Shin et al. (2010)에서 나타난 초 고압 처리 후 홍삼 내 유효물질의 추출 수율 증가와 Jeong et al. (2010)의 초고압을 이용한 고로쇠 항암활성 증진에서의 추출 수율이 증가한 점, Prasad et al. (2010)에 서 나타난 용안(longan)의 과피의 초고압에 따른 추출 수 율의 변화와 유사한 경향을 나타낸 것으로 볼 수 있다. Kim et al. (2010)에서 이미 추출 수율이 증대될 수 있음 을 확인한 바가 있으며, 이와 같은 결과는 실제 초고압을 이용한 더덕 제품의 생산공정을 설계하는데 있어서 시간을 줄일 수 있을 것이라 판단된다. 또한 Uhm & Yoon (2011) 의 대두분말의 초고압 처리 하에 유기용매에 의한 추출 수 율의 증가와 유사한 경향으로, Uhm & Yoon (2011)은 SEM을 통하여 초고압 처리에 의한 대두 내부조직의 변화 를 보여 주어 내부저항의 감소에 따른 확산속도의 증가에 기인함을 보여 주었다. 초고압 처리에 따른 총 phenol 함 량의 증가는 Prasad et al. (2009)에서 추출 수율 또한 증 가함을 확인할 수 있다. 초고압처리는 물질이동을 증가시 켜줄 뿐 아니라 가로막는 세포막에서 세포벽과 소수성 결 합 용매 침투율도 증가시켜주는 것을 확인할 수 있다 (Dornenburg & Knorr, 1993; Barbosa-Canovas et al., 1998; Oey et al., 2008). 처리시간에 따라 유의 차가 없음은 30 분간의 처리 시 더 이상의 내부구조에 의한 총 phenol 함 량이 동일한 추출조건(예, 온도, 시간, 용매 비)에서는 변화 되지 않기 때문이라 사료된다. 초고압 처리 시간이 유의 차가 없음을 확인함에 따라 이후 모든 초고압 처리 과정은 10분간의 처리 시간에서 수행되었다.

Fig. 2. Changes in total phenols concentration of deodeok flesh by particle size treated with 250MPa for 10 min and 30 min. Values for a given fraction sharing the same superscript are not significantly different at p<0.1.

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외피와 육질을 250 MPa과 450 MPa의 초고압 하에서 10 분간 처리하였을 경우의 입자도에 따른 총 phenol 함량을 Fig. 3(a)와 (b)에 나타내었다. 육질의 경우 450MPa의 압 력에서는 250MPa의 압력과 달리 입자도에 대한 의존성도 사라졌으며 250MPa의 압력하에서 100mesh 이하의 입자 크기에서 얻은 총 phenol 함량과 유사한 결과를 얻었다.

Fig. 3. Changes in total phenols concentration of deodeok flesh and skins treated in high pressure at (a) 250MPa and (b) 450MPa for 10 min by particle size. Values for a given fraction sharing the same superscript are not significantly different at p<0.1.

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외피의 경우 초고압 처리에 250MPa의 압력처리에 의해서 는 유의적으로 입자도가 감소함에 따라 총 phenol 함량이 증가함을 보였으나, 450MPa에서는 입자도에 따라 유의 차가 없음을 보였다. 또한 450MPa에서 250MPa의 처리 결과와 비교 시 더 이상 총 phenol 함량이 증가하는 추세 를 보이지 않았다. Jun et al. (2009)에서 확인할 수 있듯이 녹차 잎에서 polyphenol 성분을 초고압 추출 시 압력에 따 른 유의 차가 나타나다가 높은 압력에서는 유의 차가 거의 나타나지 않는 것과 유사한 현상으로 볼 수 있다. 녹차 잎 에서 초고압을 이용한 카페인 추출에서도 압력에 따라 유 의 차가 나타나다 높은 압력이 되었을 때, 유의 차가 없어 짐을 확인할 수 있었다. 이에 따라 높은 초고압에 따른 내 부 물질의 빠른 용출이 일어남에 따라 입자도 간의 차이가 상쇄된 것으로 추정된다.

총 phenol 함량은 Kim et al. (2010)에서 실시한 열수 추출물의 결과와 비교하였을 때, 외피와 육질을 분리하지 않고 건조하여 얻어진 분말의 경우 본 실험에서 나온 결과 와 유사한 값을 보였으나, 외피의 경우에는 5.8배에서 6.12 배의 차이가 났다. 초고압을 적용한 경우는 3.4배에서 4배 정도의 차이가 나타났다. 이와 같은 차이는 추출방법과 시 료의 차이에서 기인한 것으로 보여진다. 열처리 온도와 처 리시간에 따른 항산화 물질의 추출량은 Hwang et al. (2011)에서 확인할 수 있다.

환원력은 항산화 작용의 여러 가지 기작 중에서 활성 산 소종 및 유리기에 전자를 공여하는 능력을 측정함을 통해 서 항산화 활성을 검정하는 수단으로 이용될 수 있다(Kim et al., 2010). 환원력이 강한 물질일수록 녹색으로 발색하 며, 항산화 활성이 큰 물질일수록 높은 흡광도 값을 나타 낸다(Yim et al., 2006). 외피와 육질을 분리하지 않은 더 덕과 외피와 육질의 환원력을 입자도별로 측정하였다(Fig. 4). 외피와 육질이 분리되지 않은 더덕의 경우 입자도가 감 소함에 따라 환원력이 감소하는 경향을 보여주었다. 이는 총 phenol에서 나타난 경향과 동일한 경향이다. 반면 육질 의 경우에는 입자의 크기가 감소함에 따라서 환원력이 증 가하는 경향을 보여 육질에서의 입자도에 따른 추출효과는 외부저항이 무시되는 경우의 물질전달현상에 의한 추출 기 작에 따름을 보여주었다(Geankoplis, 2003). 외피의 경우에 는 입자의 크기에 따른 유의 차가 존재하지 않았다. 초고 압 처리(250 MPa과 450MPa)를 10분간 한 시료의 환원력 의 변화를 Fig. 5(a)와 (b)에 나타내었다. 초고압 처리 시료 의 환원력은 총 phenol 함량의 경우와 비교 시 상대적으로 적은 효과를 주었다. 입자도에 따른 효과는 더덕 내피의 경우 초고압 시료는 입자도의 영향이 없어지는 특성을 보 였으며 이는 초고압에 의한 내부저항이 저하되었음에 의함 으로 판단된다. 외피의 경우는 초고압 처리가 입자도에 영 향을 주지 못하는 경향을 보였다.

Fig. 4. Changes in reducing power of deodeok, deodeok flesh and skin by particle size. Values for a given fraction sharing the same superscript are not significantly different at p<0.1.

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Fig. 5. Changes in reducing power of deodeok flesh and skin treated in high pressure at (a) 250MPa and (b) 450 MPa for 10 min by particle size. Values for a given fraction sharing the same superscript are not significantly different at p<0.1

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더덕, 육질, 외피의 입자도에 따른 DPPH radical 소거능 을 농도를 감소하며 실시하여 확인하였다(Table 1). IC₅₀을 기준으로 DPPH radical 소거능을 측정하여 비교하였다. DPPH radical 소거능은 외피와 육질을 포함한 더덕의 경 우 입자도가 낮을수록 낮아 항산화 효과가 낮음을 보여주 었다. 반면 육질을 분리하여 측정할 시 입자도가 낮아질수 록 높은 항산화 효과를 보였다. 외피의 경우에는 입자의 크기 차이에 따른 뚜렷한 효과가 없는 것을 확인할 수 있 었다. 초고압 처리를 한 시료를 측정한 결과(Table 2), 대 부분의 샘플 조건에서 입자도에 따른 차이를 확인할 수 없 었다. 또한 이러한 항산화능은 약주와 같은 식품에 더덕을 첨가하더라도 효능이 나타남을 확인할 수 있었다(Jin et al., 2008). DPPH radical 소거능에서 나타난 결과는 총 phenol 함량과 환원력의 측정에서 나온 결과와 유사한 결 과이며, 이는 DPPH radical 소거능이 phenol류나 flavonoid 물질에 기인하여 항산화 능을 나타내는 것(Kang & Lee, 1996)에 대한 것을 확인 할 수 있다.

외피와 육질을 분리하지 않은 더덕과 분리 된 외피와 육 질에서의 SEM 화상을 촬영하였다(Table 3). SEM은 전자 총에서 나오는 전자선이 충돌해서 방출되는 원리를 이용하 여 화상을 얻는 방식이다. 따라서 금속이 아닌 생물 시료 를 그대로 사용할 수 없기 때문에 금, 백금 등의 작은 크 기의 입자를 3-4 mm정도로 얇게 부착하여 2차 전자 방출 유도와 전자선으로부터 시료를 보호하는 전처리를 거쳐야 한다(Chae, 1996). 전처리 과정을 통하여 코팅된 시료는 진공관 안에서 전자를 주사하여 선명한 이미지를 관찰하는 데 이용된다(Kim et al., 2009). 외피의 SEM화상은 외피의 구성물질이 사각형의 각을 진 형상을 많이 포함하고 있음 을 보여주고 있다. 반면 육질은 그와 같은 사각형의 형상 이 거의 없는 부정형의 형상을 보여주고 있다. 외피와 육 질을 분리하지 않은 더덕의 입자가 큰 경우(20-40 mesh) 외피의 SEM화상에서 발견된 사각형의 외피의 구조가 대 다수 발견되었으나 입자도가 작은(100 mesh 이하)경우 육 질에서 발견된 부정형의 형상을 대다수 보여주고 있다.

Table 3. Comparison of SEM images from (a) flesh, skin and (b) whole of deodeok upon different particle sizes

(a)	100x magnification	500x magnification	1000x magnification
Flesh (20~40 mesh)
Skin (20~40 mesh)
(b)	100x magnification	500x magnification	1000x magnification
Whole sample (20~40 mesh)
Whole sample (below 100 mesh)

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본 SEM화상과 앞선 항산화 측정 결과에 따라, 외피와 육질을 분리하지 않은 더덕의 경우 입자도에 따른 추출 효 과가 전통적인 물질전달현상(Vishwanathan et al., 2011)과 반대되는 현상이 나타나는 이유는 동일한 분쇄조건에서 분 쇄 시 입자의 크기가 작은 경우 더덕 육질이 주로 분포하 고 있으며 입자의 크기가 작은 경우 더덕 육질이 주로 분 포하고 있음을 나타내 주고 있다.