쌀단백질 잔사 효소분해물의 풍미증진 효과

본 실험에서 사용한 쌀 단백질은 벨기에의 Beneo-Remy NV에서 제조한 단백질 함량 80% 이상인 Remypro N80로 서 (주)빅솔(Anyang-si, Gyeonggi-Do, Korea)로부터 구입하 였으며 5'-inosine monophosphate(5'-IMP), 5'-guanosine monophosphate(5'-GMP), TCA(trichloro acetic acid)는 Sigma 사(St. Louis, MO U.S.A)에서, HPLC 분석 용매는 J.T. Baker 사(Phillipsburg, NJ, U.S.A)에서 구입하여 사용하였다. 실 험에 사용한 프로테이스인 Alcalase, Delvorase, Flavourzyme, Protamax은 (주) 비젼바이오켐(Sungnam-si, Gyeonggi-Do, Korea), 글루카네이스는 다카라(Otsu, Shiga, Japan)의 제품을 사용하였다. 효모는 Saccharomyces cerevisiae(ATCC 7754) 를 한국미생물보존센터(Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하 였다.

효모배양은 쌀 단백질(5%, w/w) 용액을 가압멸균(121℃, 15 min) 후 Alcalase, Delvorase, Flavourzyme, Protamax로 각각 효소분해(0.05%, 60℃, pH 7.0, 24 hr)하여 얻은 상 등 분획에 포도당(3%, w/w)을 첨가하고 다시 가압멸균 (121℃, 15 min) 후 Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 스타터를 접종하여 배양(30℃, 48 hr)하였다(Fig. 1). 배양이 끝난 효모는 원심분리하여 회수하고 증류수로 세척하였으며 RNase의 활성을 억제시키기 위해 열처리(90℃, 30 min) 한 후, 5'-IMP, 5'-GMP를 효율적으로 추출하기 위해(Kim et al., 1999; Chae & In, 2004), β-1,6 glucanase와 β-1,3 glucanase를 각각 10 mg/mL, NaCl를 0.5% 첨가하고 분해하여(60℃, 24 hr) 효모추출물을 제조하였다. 이 후 쌀단백질 잔사를 Alcalase, Delvorase, Flavourzyme, Protamax로 각각 다시 효 소분해(0.05%, 60℃, 24 hr)하여 얻은 가수분해물을 효모 추출물에 첨가하여 맛의 변화를 측정하였다.

Fig. 1. Manufacturing process of yeast extract supplemented with a rice protein residue hydrolysate.

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효모 배양에 사용한 쌀단백질 효소분해물의 유리 아미노 산 함량은 쌀단백질(10 mg/mL) 효소분해물을 원심분리한 상등액을 여과하고 Waters AccQ-Tag chemistry package (Waters Co., Milford, USA)를 사용해 유도체화한 후 Table 1의 조건에서 각각의 아미노산 표준품을 이용하여 검량선 을 그리고 정량분석하였다.

쌀단백질 효소분해물의 분자량 분포에 따른 맛 특성의 차이를 조사하기 위하여 Ultrafiltration cell(Amicon Co., Beverly, MA, USA)을 사용하여 분획하였는데, 우선 5 Kda Ultrafiltrationmembranes(Amicon Co., Beverly, MA, USA)을 이용하여 여과한 후 얻어진 여액을 다시 1 Kda membrane으 로 여과하여 분획한 5 Kda와 1Kda범위의 쌀단백질 가수분 해물과, 1 Kda이하의 쌀단백질 가수분해물로 분리하여 gel filtration chromatography를 실시하였다. 쌀단백질 가수분해 물의 분자량 분포는Superdex Peptide 10/300GL column (10×300mm, AmershamPhamacia Biotech, Uppsala, Sweden)이 장착된 prep-FPLC system(fast protein liquid chromatography; AKTA, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 이 용하여 분석하였는데 30% acetonitrile을 이동상으로 isocratic 조건에서 유속 0.5 mL/min, 214 nm에서 검출하였 다. 쌀단백질 정제 분획물의 정성적 확인은 LC-MS/MS를 사용하여 Table 2의 조건에서 실시하였다.

객관적으로 시료들의 맛의 차이를 확인하기 위해 맛센서 분석기(Insent, Atsugi, Japan)를 사용하여 검사하였다. 지질 막 전극으로 구성되어 있는 맛센서는 포화 AgCl/3.3M KCl 용액으로 채우고, 기준센서와 측정센서를 시료에 넣어 측정하였는데 이 때 시료는 1%(w/w) 농도로 증류수에 녹 인 후 원심분리한 상등액 35 mL을 맛센서용 시료 용기에 넣어 4회 반복 측정 하고 1회 차에 측정한 값을 제외한 나머지 값의 평균을 이용하여 나타내었다. 실험 결과는 SPSS를 이용하여 통계처리 하였고, 표준편차를 산출하여 표시하였으며, 평균값의 통계적 유의성은 one-way ANOVA 를 이용하여 p < 0.05 유의 수준에서 Duncan's multiple range test로 유의성을 검증하였다.

쌀단백질을 exo형 프로테이스인 Alcalase, Delvolase, Protamax와 exo- 및 endo형 프로테이스인 Flavourzyme으 로 각각 분해하여 효모추출물 제조용 배양액을 만든 다음, 남은 쌀단백질 잔사를 다시 동일한 종류의 프로테이스로 각각 분해하여 가수분해물들을 얻고 쌀단백질 잔사의 가수 분해도를 측정하였다. 각각의 프로테이스에 의한 쌀단백질 잔사의 가수분해도는 시간이 경과함에 따라 증가하였는데 대부분 반응 1시간 이내에 빠르게 가수분해 되는 것으로 나 타났다. Alcalase, Protamax와 Flavourzyme의 처리구들은 12 시간 이후부터는 가수분해 속도가 감소하였으나 Delvolase 처리구는 24시간까지 가수분해도가 증가하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Degree of hydrolysis (%) of rice protein residue with various proteases. ¹⁾Rice proteinresiduehydrolysate by Delvolase ²⁾Rice proteinresiduehydrolysate by Protamax ³⁾Rice proteinresiduehydrolysate by Alcalase ⁴⁾Rice proteinresiduehydrolysate by Flavourzyme

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각각의 쌀단백질 잔사 효소분해물의 맛 특성을 측정해 본 결과는 Flavourzyme 처리구의 감칠맛이 10.83으로서 다른 처리구에 비하여 1 이상 높은 것을 볼 때 상대적으 로 감칠맛이 강함을 알 수 있었다. Flavourzyme의 처리구 (Rrhf)를 효모추출물(Yx)에 첨가한 시료(Yx+Rrhf)는 감칠 맛이 첨가 전의 4.88에서 첨가 후에는 10.38로 증가하였으 며 쓴맛은 8.47에서 8.93으로 증가하였으나 증가치가 1 이 하로서 관능적으로 감지될 정도는 아니었다(Table 3). Flavourzyme은 exo형과 endo형의 프로테이스 특성을 보유 한 효소로서 폴리펩타이드를 올리고펩타이드로 분해함과 동시에 이로 인해 노출된 아미노산 잔기로부터 아미노산을 유리시키는 작용기작을 보인다. 이러한 결과는 Flavourzyme 이 다른 효소보다 쌀단백질의 펩타이드결합을 분해하는데 효과적이나 가수분해 과정 중 생성되는 저분자 펩타이드나 Ile, Leu, Phe등 쓴맛을 나타내는 소수성 아미노산도 많이 생 성되어 쓴맛을 줄 수도 있다. 쌀단백질 잔사를 Flavourzyme 으로 분해하여 얻은 Rrhf는 잔류 아미노산 조성이 다른 효 소 처리구와 다름에도 불구하고 쓴맛은 Protamax처리구 외 의 다른 처리구와는 크게 차이가 나지 않았다(Table 4). Protamax처리구(Rrhp)는 감칠맛이 9.61로서 Flavourzyme처 리구에 비해서 감칠맛은 상대적으로 약했지만 쓴맛은 3.28 로서 Flavourzyme처리구(Rrhf, 8.08)나 Delvorase처리구 (Rrhd, 9.13), Alcalase처리구(Rrha, 9.59)에 비하여 상당히 적 어서 단백질의 효소분해물에서 일반적으로 나타나는 쓴맛에 의한 기호도 저하를 보완할 수 있을 것으로 예측되었다 (Table 5). Protamax처리구(Rrhp)를 효모추출물(Yx)에 첨가 한 시료(Yx+Rrhp)는 감칠맛이 첨가 전의 4.88에서 첨가 후에는 9.6으로 증가하였으며 쓴맛은 8.47에서 6.9로 감소 하여 효소분해물의 첨가효과가 효모추출물의 맛을 보완하 는 것으로 나타났다(Table 5). Delvorase처리구(Rrhd) 나 Alcalase처리구(Rrha)는 감칠맛이 각각 9.59, 9.69로서 Protamax처리구와 유사하였으나, 쓴맛은 각각 9.13, 9.59로서 Protamax처리구에 비하여 강한것으로 나타났다(Table 6, 7). 이와 같이 Protamax처리구의 쓴맛이 다른 효소처리구에 비하여 상대적으로 약한 것은 쓴맛을 나타내는 잔류 유리 아미노산 및 쓴맛 펩타이드의 함량이 적기 때문인 것으로 보여지며(Table 4), 쌀단백질 잔사를 Protamax로 처리한 효 소분해물의 첨가에 의하여 감칠맛은 증가시키면서 식물성 효소가수분해물에서 문제가 되는 쓴맛의 증가는 최소화할 수 있을 것으로 예상되었다.

Protamax처리구(Rrhp)에는 Asp나 Glu와 같은 감칠맛을 나타내는 아미노산이 적었음에도 불구하고(Table 4), Rrhp 를 첨가한 효모추출물의 감칠맛이 상승한 것은 Rrhp에 감 칠맛의 상승에 관여하는 다양한 성분이 존재할 것으로 예 측되어 Rrhp를 분자량에 따라 한외여과한 후 FPLC를 사 용하여 분리한 펩타이드의 패턴을 조사하였다. 이 때 각각 의 펩타이드는 자체적으로 감칠맛을 내기도 하지만 때로는 효모추출물에 함유된 핵산 유래의 감칠맛 성분과 상승작용 을 일으켜 감칠맛을 증진시킬 수도 있기 때문에 각 펩타이 드의 구체적인 특성을 살펴볼 필요가 있었다.

Ogasawara(2006)는 분자량 1-5 Kda범위의 마일라드 반응 생성 펩타이드가 자체는 맛이 강하진 않지만 감칠맛의 상 승 작용을 통하여 우수한 풍미를 나타낸다는 결과를 발표 하였다. 따라서 Rrhp를 한외여과막을 이용하여 분자량 1- 5 Kda범위로 조분획하고 이어서 FPLC를 이용하여 분리한 주요 분획을 LC-MS/MS로 아미노산 서열을 분석하였다. 먼저 Rrhp의 분자량별 패턴을 분석한 결과 대부분 분자량 1-5 Kda범위의 피크는 15-35분 사이에 용출되었으며 분자 량 1 Kda 이하의 피크는 35분 이후에 용출되었는데(Fig. 3) 분자량 1-5 Kda범위의 33.05분에서 가장 큰 피크가 용 출되었으며 이 분획을 LC-MS/MS 분석한 결과 Ile-Gly- Tyr-Pro-Thr-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg(Mw: 1175) 등의 올리고펩 타이드류가 함유되어 있음을 알 수 있었다. Wang 등이 (1996) beefy meaty peptide와 같은 올리고 펩타이드류가 핵 산성분과 어울려 상승작용을 나타낸다고 보고한 내용과 상 관성이 있는 것으로 예상되었다. 이와 같이 쌀단백질 잔사 를Protamax로 적정 조건에서 효소분해하여 제조한 Rrhp는 이들에 함유된 다양한 펩타이드성분이 효모추출물의 풍미 를 증진시키는 효과를 발현할 수 있을 것으로 예측되어 천 연 조미소재로의 활용이 가능함을 알 수 있었다.

Fig. 3. Size exclusion chromatogram (A) and total ion chromatogram (B) of a rice protein residue hydrolysate by Protamax.

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